糞便病原菌的分離與鑒定

關于糞便病原菌的分離與鑒定12實驗目的

糞便標本中常含有很多雜菌，應根據檢驗目的菌的不同而選擇培養(yǎng)基，以利于病原菌的檢出。而且，因其各種正常菌群含量甚多，僅以染色性和形態(tài)無法分辨是否為病原菌。常見的病原菌有志賀氏菌屬、致病性大腸桿菌屬、弧菌屬、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌等。

這次實驗中我們從糞便標本中檢出的是大腸埃希菌、痢疾志賀菌。而且，我們從這次的綜合性實驗中了解到了醫(yī)學微生物學主要的研究方法和手段，掌握了微生物試驗的基本技能和基本原理，樹立了牢固的無菌觀念。同時培養(yǎng)了我們的動手能力和表達能力。第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3糞便標本直接糞便檢查

革蘭染色單染色動力觀察及制動試驗初步結果報告需氧培養(yǎng)增菌培養(yǎng)直接分離堿性胨水堿性平板分離菌落形態(tài)抗血清凝集生化反應增菌液菌落形態(tài)抗血清凝集生化反應SS平板副溶血性弧菌選擇性平板菌落形態(tài)生化反應厭氧培養(yǎng)微需氧培養(yǎng)及特殊培養(yǎng)實驗結果第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4

1.實驗材料接種針、接種環(huán)、油性筆、打火機、試管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、奧林巴斯CX21型生物顯微鏡、1500W電爐、蒸餾水、玻片缸、消毒液、1‰新潔而滅、天平、砝碼、細菌干粉培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、半固體瓊脂）、錐形瓶、量筒、試管筐、糖發(fā)酵微量管（葡萄糖、乳糖）、滅菌平皿、試管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、稱量紙、硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋、尺子、藥勺、革蘭氏染色液（結晶紫染液、盧戈碘液、95％乙醇、稀釋石炭酸復紅）、小砂輪、痢疾血清、青霉素、鏈霉素、慶大霉素和生理鹽水濾紙片、線繩、香柏油、擦油紙第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天5

2.實驗方法2.1培養(yǎng)基的制備、消毒和滅菌培養(yǎng)基制備的一般程序：調配→溶化→矯正pH→分裝→滅菌→檢定→保存。干粉培養(yǎng)基→蒸餾水→加熱溶化→分裝→滅菌→檢定→保存。干粉培養(yǎng)基→蒸餾水→加熱溶化→分裝→集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙，牛皮紙，用橡皮筋扎好→放入講臺邊的高壓滅菌桶或高壓滅菌筐內→送到高壓滅菌室（洗刷室）。第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天6

表1.培養(yǎng)基的制備組號培養(yǎng)基稱量(g)水量(ml)煮沸(次)分裝(ml)備注(24人分)1營養(yǎng)瓊脂11.43003瓶，500ml瓶，平板2,3營養(yǎng)瓊脂2.9753515支，中試管，斜面6營養(yǎng)肉湯2.0901330支，小試管，液體7,8半固體1.5503315支，小試管，高層第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天72.2細菌的分離與培養(yǎng)

2.2.1采用平板劃線分離法，將取糞便標本中混雜的多種細菌，在伊紅美藍固體培養(yǎng)基表面劃線，使之分散成單個細菌，在37℃培養(yǎng)24h，從而分離出肉眼可見的單個菌落。

2.2.2細菌在固體培養(yǎng)基上生長特征的觀察。觀察形成菌落的大小、形狀、邊緣、表面、溶血性、色素、透明度、濕潤度。2.2.3細菌的純培養(yǎng)。糞便標本在伊紅美藍平板上，有紫黑色、粉紅色兩種菌落。挑選這兩種不同菌落分別在斜面培養(yǎng)基上接種，標記，在37℃培養(yǎng)18h。2.2.4細菌在斜面培養(yǎng)基上生長特征的觀察。觀察細菌的生長量、菌苔形狀、表面形狀、光澤、透明度、顏色等。2.2.5液體培養(yǎng)基接種法。用接種環(huán)在固體或斜面培養(yǎng)基上挑選紫黑色和粉紅色菌苔少許移入液體培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調和，使菌液混合于培養(yǎng)基中，混勻。在35℃培養(yǎng)4~6h，觀察細菌的生長情況第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天82.3細菌個體形態(tài)特征的觀察2.3.1取兩塊玻片，在每塊玻片上加生理鹽水3～4ul，2滴，在斜面培養(yǎng)基上取紫黑色菌苔少許（1mm小菌落的半量）與第一塊玻片上的一滴鹽水混勻，再取粉紅色菌苔少許（1mm小菌落的半量）與第二塊玻片上的一滴鹽水混勻，涂成1cm2；做好標志。經在空氣中干燥后，再用酒精燈對其進行固定。2.3.2革蘭染色。用結晶紫對以上兩塊已固定的玻片進行初染1分鐘，水洗；再用盧戈碘液媒染1分鐘，水洗；然后用95％乙醇對其進行脫色約20秒鐘，水洗；最后用稀釋復紅復染1分鐘，水洗；吸干，在顯微鏡下鏡檢。第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天92.4細菌生化反應鑒定2.4.1糖發(fā)酵試驗。用接種針分別挑少許紫黑色和粉紅色的細菌接種到葡萄糖發(fā)酵微量管和乳糖發(fā)酵微量管中，將微量管放在平皿蓋內，在37℃下，培養(yǎng)24小時，觀察其產酸產氣情況。2.4.2細菌藥物敏感性試驗。接種環(huán)分別取紫黑、粉紅色兩種菌液3～6ul×2環(huán)，各自在兩個平板上，作平板密集劃線接種細菌（紗窗樣）。設計三點，三點之間等邊三角距離，點距離平皿邊緣約15mm。作標記：青、鏈、慶。鑷子火焰消毒，夾取相應的藥物紙片，平貼在已設定的位置上，按壓，最后鑷子火焰滅菌。37℃18～24小時培養(yǎng)，觀察結果。2.4.3半固體接種法。接種針斜面取紫黑和粉紅色的細菌，各自接種進兩個半固體培養(yǎng)基，從半固體培養(yǎng)基中心，垂直刺入，到達培養(yǎng)基底部4/5處，再循原來的路線，退出接種針。在37℃下,培養(yǎng)24小時，觀察結果。2.4.4痢疾血清玻片凝集反應。取載玻片1張，滴加痢疾血清和生理鹽水各15ul，2滴。用接種環(huán)挑取少許紫黑色菌落和粉紅色菌落，各自與上述混合液液滴混勻，觀察結果第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天103.實驗結果3.1細菌在固體培養(yǎng)基上生長特征的觀察。將糞便標本用平半分區(qū)劃分法接種于伊紅美蘭培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)出紫黑色和粉紅色兩種菌落。(見圖一)第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天113.2革蘭染色鏡檢。取紫黑色和粉紅色菌涂片，革蘭染色，進行鏡檢。紫黑色菌革蘭染色陰性，長桿狀。粉色菌革蘭染色陰性，短桿狀。（見圖二，圖三）第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天123.3糖發(fā)酵實驗和半固體培養(yǎng)基實驗。紫黑色菌兩支單糖發(fā)酵微量管均變色和產氣，粉紅色菌葡萄糖發(fā)酵管變色不產氣泡，乳糖發(fā)酵管既不變色也不產氣泡。半固體實驗中，紫黑色菌成模糊狀，粉色菌成清晰的線狀。（結果見圖四，圖五，表二）第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天13表2、糖發(fā)酵試驗和半固體培養(yǎng)基實驗結果細菌種類葡萄糖乳糖半固體紫黑色菌⊕⊕+粉紅色菌+--

由實驗結果可知：說明紫黑色細菌均能分解葡萄糖和乳糖，產酸產氣，粉色菌能分解葡萄糖，產酸不產氣，不能分解乳糖，不產酸不產氣。紫黑色菌有鞭毛，粉紅色菌無鞭毛。第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天142.4藥敏試驗。使用紙片瓊脂擴散法，觀察抑菌圈的大小，由此判斷兩種菌的藥物敏感性（現象見圖六，圖七。結果見表3）第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天152.5痢疾血清玻片凝集實驗。紫黑色菌與痢疾血清混合不出現凝集現象，而粉紅色菌與痢疾血清混合出現凝集現象，說明紫黑色菌不是引起痢疾的致病菌，粉紅色菌是引起痢疾的致病菌。第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天16在制備好培養(yǎng)基后，采用是平板劃線分離法，將糞便標本接種于伊紅美藍平板，從中分離出兩種不同的細菌：紫黑色具有金屬光澤的菌落和粉紅色半透明菌落。在顯微鏡下觀察時，這兩種菌均為G﹣桿菌，排列不規(guī)則，從形態(tài)上不能鑒別是什么細菌。經糖發(fā)酵試驗，可以觀察到，紫黑色的細菌使能使葡萄糖和乳糖的試管變色和產生氣體，粉紅色的細菌只能使葡萄糖的試管變色而無氣體，對乳糖無反應；經半固體動力試驗，觀察到紫黑色的細菌使半固體培養(yǎng)基成渾濁狀態(tài)，粉紅色的細菌只在接種針插入的方向聚集。由此初步推斷，紫黑色的細菌可能為大腸埃希菌，粉紅色的為痢疾志賀菌（參見表四和表五）。進行痢疾血清玻片凝集實驗，紫黑色菌無凝集現象，粉色菌有凝集現象，因此可以斷定粉色菌為痢疾志賀菌，紫黑色菌極可能為大腸埃希菌。做藥敏試驗時，發(fā)現大腸埃希菌和痢疾志賀菌均對青霉素不敏感，對慶大霉素和鏈霉素都敏感。第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天17

THEEND!謝謝觀賞！第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天18第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天19第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天20圖一第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天21圖二紫黑色菌革蘭染色后在顯微鏡下的形態(tài)

第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天2