細(xì)胞因子及抗體檢測技術(shù)

關(guān)于細(xì)胞因子及抗體檢測技術(shù)背景知識研究細(xì)胞因子對闡明機體免疫應(yīng)答及其調(diào)節(jié)機制、免疫相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和指導(dǎo)臨床治療均具有重要意義抗體具有高特異性、高親和力等特點，目前已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、微生物學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等各個領(lǐng)域第2頁,共44頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞因子的檢測方法：

1)生物學(xué)方法①依賴性細(xì)胞株：生物分析法②功能檢測：生物分析法

2)分子生物學(xué)方法①分子雜交技術(shù)：mRNA表達(dá)水平的測定②多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）：mRNA的測定

3）免疫學(xué)方法①免疫測定：免疫酶技術(shù)②功能測定與抗體抑制第3頁,共44頁，2024年2月25日，星期天抗體檢測技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)間接血凝試驗放射免疫測定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測定

第4頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

酶聯(lián)免疫吸附測定實驗

(ELISA)

Enzymelinkedimmunosorbentassay

第5頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

基于NP30抗獨特型抗體可替代蟲源性抗原率先應(yīng)用生物技術(shù)制備抗原代替?zhèn)鹘y(tǒng)蟲源抗原血吸蟲抗體屬短程抗體，治療后陰轉(zhuǎn)較快，具有療效考核價值

該試劑盒的診斷效能多項指標(biāo)均已達(dá)到或超過經(jīng)典抗體檢測法，較以前病原學(xué)檢查和免疫學(xué)檢測方法，更為簡便快速優(yōu)點：僅用一滴血，20分鐘即可判讀結(jié)果，不需其他儀器設(shè)備，便于在基層、現(xiàn)場使用本試劑盒已在血吸蟲流行區(qū)已應(yīng)用近120萬人次

第6頁,共44頁，2024年2月25日，星期天管曉虹（1946-2012），女，漢族，江蘇丹陽人，博士，教授，博士生導(dǎo)師。農(nóng)工民主黨員。農(nóng)工民主黨第十二、十三屆中央常委，第九、十屆全國人大代表，江蘇省婦聯(lián)副主席。1970年畢業(yè)于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)；1981和1985年先后在原南京醫(yī)學(xué)院獲醫(yī)學(xué)碩士和醫(yī)學(xué)博士學(xué)位；1988年在美國布朗大學(xué)作博士后研究。曾任寄生蟲學(xué)教研室副主任、江蘇省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室主任、衛(wèi)生部抗體技術(shù)重點實驗室主任。

承擔(dān)國家“七五”、“八五”、“九五”科技攻關(guān)項目各1項（血吸蟲病免疫診斷）；國家“863”計劃項目1項和國家自然科學(xué)基金項目6項；發(fā)表論文100余篇；主編或參編衛(wèi)生部規(guī)劃教材6部；獲部省級科技進(jìn)步二等獎2項、三等獎2項；獲國家發(fā)明專利授權(quán)6項。獲“全國優(yōu)秀教師”、“國家級有突出貢獻(xiàn)的中青年專家”等榮譽稱號。享受國務(wù)院政府特殊津貼。

第7頁,共44頁，2024年2月25日，星期天實驗原理是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫技術(shù)此項技術(shù)自70年代初問世以來,發(fā)展十分迅速優(yōu)點：微量、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、方便、安全等廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域第8頁,共44頁，2024年2月25日，星期天實驗原理

ELISA利用了免疫反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性檢測抗原或抗體使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步驟進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)加底物顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析第9頁,共44頁，2024年2月25日，星期天方法類型

ELISA既可測抗原又可測抗體，根據(jù)試劑來源、標(biāo)本性狀以及檢測的具體條件，可設(shè)計出不同類型的檢測方法：

1.直接法

2.間接法

3.雙抗體夾心法

4.雙夾心間接法第10頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共44頁，2024年2月25日，星期天一、試劑及儀器準(zhǔn)備（一）免疫吸附劑1.固相載體⑴要求：①吸附力強②能保持Ag或Ab活性③不參與化學(xué)反應(yīng)

第13頁,共44頁，2024年2月25日，星期天⑵載體性能比較

要求：載體材料+、-結(jié)果差別大

檢測方法：10ug/LIgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測20孔的OD，要求CV<10%⑶常用載體：

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等

形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板第14頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.Ag或Ab：純度高、效價高、結(jié)合力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：

包被：將Ag或Ab固相化的過程包被緩沖液、包被方法

封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾第15頁,共44頁，2024年2月25日，星期天㈡酶結(jié)合物：1.要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、標(biāo)記后穩(wěn)定2.常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等3.底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍(lán)色(450nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm)魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色：

DAB：棕黃色α-萘酚：紅色3-氧基-9-乙基卡唑：紅色4-氯-1-萘酚：灰藍(lán)色AP可溶性底物及呈色：對硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光AP不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色堅固紅和萘酚ASMX混合液：紅色

?-半乳糖苷酶：

4-甲基傘基-?-半乳糖苷：熒光第16頁,共44頁，2024年2月25日，星期天4.酶結(jié)合物的制備：戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法第17頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（三）設(shè)備：酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀

指測讀ELISA光度計；針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計性能指標(biāo)：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%操作：室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30min，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀第18頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共44頁，2024年2月25日，星期天二、操作步驟

（間接ELISA法）

樣本的收集包被抗原封閉加稀釋的待檢樣品加酶標(biāo)抗抗體加底物顯色終止反應(yīng)第20頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（一）樣品的收集和保存：

1.溶血標(biāo)本可增加非特異性顯色(Hb作用于HRP的輔基)；

2.細(xì)菌污染標(biāo)本因菌體內(nèi)源性酶而假“-”(破壞Ag或Ab)或假“+”(非特異蛋白)；

3.反復(fù)凍融可使抗體效價下降而假“-”；

4.陳舊標(biāo)本可使IgG聚集，引起間接法本底增加；

5.標(biāo)本中含NaN3，可出現(xiàn)假“-”。第21頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（二）包被包被(coating)：將抗原或抗體固定在固相載體的過程

原理：物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用；這種物理吸附是非特異性的影響因素：受蛋白質(zhì)分子量、等電點、濃度等

大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面第22頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

包被條件

pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2磷酸鹽緩沖液

pH7-8Tris-HCl緩沖液。

方法：加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜或37℃中保溫2小時。

濃度：隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml第23頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

最適工作濃度的選擇

可用棋盤滴定法在夾心ELISA法中選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度，即利用棋盤滴定，將包被抗體和酶標(biāo)抗體稀釋成一系列濃度，反應(yīng)后顯色。陽性值在0.8左右，陰性值小于0.1為最適，可據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度第24頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

方陣(棋盤)滴定法選擇包被抗原的工作濃度用包被液將抗原作一系列稀釋(1:50～l:800)后，按行進(jìn)行包被、洗滌。按列分別加入用稀釋液1:100稀釋的強陽性、弱陽性、陰性參考血清及稀釋液(作空白對照)，保溫，洗滌。加工作濃度酶標(biāo)抗體，洗滌，加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。選擇強陽性參考血清A值；為0．8左右，陰性參考血清A值<0．1的包被抗原稀釋度為工作濃度

第25頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（三）封閉封閉(blocking)：是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。第26頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（四）加樣（抗原或抗體）純化抗原/抗體：天然但干擾多合成抗原/抗體：多肽分子較小，常有空間位阻基因抗原：與片段的選擇和制備水平有關(guān)第27頁,共44頁，2024年2月25日，星期天對照設(shè)定陽性對照品(positivecontrol)陰性對照品(negativecontrol)目的:

是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照。要求：陽性對照品：基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物質(zhì)的量陰性對照品：須先行檢測確定不含待測物質(zhì)第28頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（五）加酶標(biāo)抗體

酶標(biāo)記的抗體（原）：ELISA中關(guān)鍵的試劑要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等第29頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（六）顯色

顯色：酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。影響因素：溫度、時間

在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB：受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。第30頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（七）結(jié)果判定

操作方法：拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計算。

結(jié)果判定：光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。第31頁,共44頁，2024年2月25日，星期天定性測定

定性測定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔第32頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.定量測定

ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。第33頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共44頁，2024年2月25日，星期天三、基本操作注意事項（一）加樣:一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。方法：加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。第35頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（二）孵育

ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的孵育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。第36頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（三）洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。洗滌目的：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性