HPLC法測定硝呋太爾制霉菌素軟膠囊中制霉菌素含量的方法研究

HPLC法測定硝呋太爾制霉菌素軟膠囊中制霉菌素含量的方法研究【摘要】目的：建立測定硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素含量的HPLC法。方法：采用振蕩加低溫超聲的方式對硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊內(nèi)容物進行提取。采用HPLC法測定其中制霉菌素的含量。色譜條件：色譜柱為ECOSILC18(4.6*250mm，5μm)，流動相A溶液為0.38%乙酸銨溶液-乙腈（71：29），流動相B溶液為0.38%乙酸銨溶液-乙腈（40：60），線性梯度洗脫；流速1.5mL/min；柱溫控制為35℃；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為305nm，進樣量為10μL，運行時間約70min。結(jié)果：硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素含量測定方法的專屬性好，輔料空白對主成分無干擾影響；重復(fù)性較好；中間精密度較好；制霉菌素濃度在0.04mg/mL~1.0mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；另外，回收率93.02%~97.49%，相對標準偏差1.74%，均符合要求。結(jié)論：硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素含量測定的高效液相色譜法，方法可行，可為硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊的質(zhì)量控制提供更方便準確的檢測方法?！娟P(guān)鍵詞】硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊；制霉菌素；高效液相色譜法；含量測定

StudyonthemethodofdeterminationofnystatincontentinnifurtelnystatinsoftcapsulesbyHPLCmethod[Abstract]Objective:ToestablishanHPLCmethodforthedeterminationofnystatincontentinnifurterolnystatinvaginalsoftgels.Methods:Thecontentsofnifurterylnystatinvaginalsoftgelswereextractedbyshakingandcryoultrasound.ThecontentofnystatinwasdeterminedbyHPLCmethod.Chromatographicconditions:thecolumnwasECOSILC18(4.6*250mm,5μm),mobilephaseAsolutionwas0.38%ammoniumacetatesolution-acetonitrile(71:29),mobilephaseBsolutionwas0.38%ammoniumacetatesolution-acetonitrile(40:60),lineargradientelution;Flowrate1.5mL/min;Thecolumntemperatureiscontrolledto35℃;Thedetectorisanultravioletdetectorwithadetectionwavelengthof305nm,aninjectionvolumeof10μL,andarunningtimeofabout70minutes.Results:Thedeterminationmethodofnystatincontentinnifurtelnystatinvaginalsoftgelshasgoodspecificity,andtheblankofauxiliarymaterialshasnointerferenceeffectonthemaincomponents;Goodrepeatability;Theintermediateprecisionisbetter;Theconcentrationofnystatinhadagoodlinearrelationshipintherangeof0.04mg/mL~1.0mg/mL.Therecoveryrateofthismethodwas93.02%~97.49%,andtherelativestandarddeviationwas1.74%,allofwhichmettherequirements.Conclusion:Thehighperformanceliquidchromatographymethodforthedeterminationofnystatincontentinnifurterylnystatinvaginalsoftgelsisfeasible,whichcanprovideamoreconvenientandaccuratedetectionmethodforthequalitycontrolofniturterylnystatinvaginalsoftgels.[Keywords]NifurterolnystatinvaginalsoftgelsNystatinHighperformanceliquidchromatographyContentdetermination

目錄TOC\o"1-3"\h\u1文獻綜述 文獻綜述研究的目的與意義抗生素自20世紀40年代被發(fā)現(xiàn)以來，被廣泛用于預(yù)防和治療疾病，因為它們具有有效的抑菌和殺菌作用，可以迅速解決由細菌感染引起的疾病。然而，在現(xiàn)實生活中，抗生素的不規(guī)范使用會導(dǎo)致抗生素的濫用，從而導(dǎo)致危害人類健康的問題，例如耐藥性。后政府出臺了一系列管控抗生素使用的政策。因此，建立一個高效、準確的檢測方法很有必要，以保證抗生素的正確合理使用和抗生素類藥品的安全生產(chǎn)。當(dāng)下婦科相關(guān)疾病廣受重視，而陰道炎是一種易引起患者多種不適癥狀的常見婦科疾病，其中硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊是針對陰道炎治療的有效制劑REF_Ref29389\r\h[1]。目前中國藥典、歐洲藥典、美國藥典等均有收載制霉菌素及其相關(guān)劑型的質(zhì)量標準，但硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊作為較新劑型，上述藥典中均沒有針對該劑型中制霉菌素含量測定的具體方法。硝呋太爾制霉菌素軟膠囊作為多組分藥物制劑，建立一種切實可行的檢測方法對其制霉菌素含量進行監(jiān)控，對提高產(chǎn)品質(zhì)量具有重大意義。制霉菌素的概述制霉菌素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)制霉菌素（nystatin），分子式為C47H75O17，具有共軛多烯大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)式見圖1。圖1制霉菌素結(jié)構(gòu)式作為人類發(fā)現(xiàn)第一種抗霉菌的抗生素，最早被發(fā)現(xiàn)于土壤微生物Streptomycesnoursei分泌的物質(zhì)中REF_Ref29611\r\h[2]。制霉菌素對真菌類微生物的生長有一定的抑制作用。制霉菌素利用真菌細胞膜的固醇形成孔道，增加其通透性，促進滲出胞內(nèi)的重要物質(zhì)，使真菌死亡?；谶@個原理，我們發(fā)現(xiàn)制霉菌素不具有抗細菌的能力，因為缺少增加通透性的重要物質(zhì)固醇REF_Ref29699\r\h[3]。因此制霉菌素臨床上通常用于皮膚、口腔念珠菌感染的外用治療REF_Ref29764\r\h[4]。制霉菌素通常是一種多組分混合物，其中可能包含制霉菌素A1、A2、A3和其他成分REF_Ref29904\r\h[5]REF_Ref29908\r\h[6]，是Hazen、Brown在1959年時首次分離成功。后來，蔡潤生等人采用從土壤中分離、發(fā)酵的方法，獲得了國內(nèi)生產(chǎn)的制霉菌素。據(jù)相關(guān)資料顯示，國產(chǎn)制霉菌素?zé)o論是成分的組成、生物效價等都與國外的有一定的不同，因此后改名為制霉素，以區(qū)分制霉菌素REF_Ref29976\r\h[7]REF_Ref29980\r\h[8]。硝呋太爾與制霉菌素硝呋太爾(nifurate1)REF_Ref30051\r\h[9]是由意大利普利化學(xué)工業(yè)公司獨家研發(fā)生產(chǎn)的新藥，專門為婦科疾病中混合性感染的治療所研制REF_Ref30156\r\h[10]。硝呋太爾屬于廣譜抗微生物的藥物，為硝基呋喃類衍生物，對女性生殖系統(tǒng)中的滴蟲、白念珠菌等常見的致病菌都有很好的抑制作用。制霉菌素與硝呋太爾聯(lián)合制成的劑型有陰道栓、陰道軟膏、陰道軟膠囊。其中，由于軟膠囊制劑劑型的安全穩(wěn)定方便等優(yōu)勢，近年來在臨床中的運用頻率顯著提升。在婦科陰道炎疾病中運用硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊可取得良好成效，相關(guān)研究顯示，滴蟲性、霉菌性、細菌性陰道炎臨床治療總有效率均達到了90%以上，此外患者在此藥物使用過程中有著相對較低的不良反應(yīng)發(fā)生率REF_Ref30238\r\h[11]。在臨床應(yīng)用中，相關(guān)治療都是硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊多與其他藥物配合，加速療效。如與奧硝唑栓聯(lián)合使用，臨床上治療效果良好，尤其是滴蟲性陰道炎，并可減輕微炎性反應(yīng)狀態(tài)，不良反應(yīng)少，復(fù)發(fā)率低，安全性高REF_Ref30394\r\h[12]REF_Ref30398\r\h[13]。與伊曲康唑配合治療，可以提高念珠菌性陰道炎臨床療效，減少相關(guān)疾病的復(fù)發(fā)率REF_Ref30469\r\h[14]。與紅核婦潔洗液搭配，治療外陰陰道假絲酵母菌病，即降低了副作用的反應(yīng)，又加速療效，對臨床上參考價值極高REF_Ref30528\r\h[15]。抗生素類藥品含量檢測方法研究在現(xiàn)有研究中，有很多檢測抗生素藥品含量的方法，如微生物檢定法、紫外-可見光分光光度法和高效液相色譜法等。確定抗生素有效性的最常見方法是微生物檢定，是運用最為廣泛的方法。經(jīng)過多年的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)該方法操作上難度不低、穩(wěn)定性差、結(jié)果誤差大，但是，歷年來依舊起著重要作用，主要是微生物驗證的直觀性優(yōu)點，因此在生物發(fā)酵所得的多組分抗生素類藥物的測定，多選擇微生物檢定法REF_Ref30610\r\h[16]。紫外-可見光分光光度法，與微生物鑒定不同，它在操作上難度極低、靈敏度高，但也由于此原因，滿足不了抗生素類藥物的復(fù)雜組分和不穩(wěn)定的活性成分比例，因此在抗生素類藥品的含量測定中紫外-可見光分光光度法使用較少REF_Ref30678\r\h[17]。高效液相色譜法(HPLC法)分離效果好，使用率高，不僅可以分離樣品中的成分，還可以準確測量各組分的峰面積峰高等具體數(shù)據(jù)來計算檢測物質(zhì)的含量，其方法已廣泛運用于各種制藥或生物醫(yī)學(xué)分析工作，是有機物質(zhì)定量分析的主要分析工具REF_Ref30734\r\h[18]。除了以上三種常見方法外，還有重量分析法、酸堿滴定法、碘量法等可用于抗生素類藥品的含量測定工作REF_Ref30776\r\h[19]。制霉菌素含量測定方法研究各國藥典中制霉菌素現(xiàn)行檢測方法研究參考國內(nèi)多個制霉菌素有關(guān)制劑所用標準，多采用效價測定與制霉菌素組分測定結(jié)合作為制霉菌素含量數(shù)據(jù)依據(jù)。其中，制霉菌素組分測定照高效液相色譜法，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，N,N-二甲基甲酰胺作為溶劑，0.38%乙酸銨溶液和乙腈按體積比29：71配制為流動相A溶液，0.38%乙酸銨溶液和乙腈按體積比40：60配制為流動相B溶液，柱溫設(shè)定為30℃，檢測波長為305nm，再以線性梯度洗脫70min，測得相關(guān)色譜圖信息。后按峰面積歸一化法計算樣品中制霉菌素A1比例，結(jié)合效價測定結(jié)果得出制霉菌素含量。制霉菌素的含量測定在英國藥典、美國藥典和日本藥典中均有收載記錄。在英國藥典中，對制霉菌素采用高效液相色譜法的方法進行含量測定，其中，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠作為固定相，溶劑為二甲基亞砜，流動相A與流動相B的配制和中國藥典相同，柱溫30℃，檢測波長305nm，再以線性梯度洗脫50min，測得相關(guān)色譜圖信息。后按峰面積歸一化法計算樣品中制霉菌素A1比例，結(jié)合效價測定結(jié)果計算制霉菌素含量。在美國藥典中，與英國藥典檢測方式幾近相似，但檢測波長為304nm。在日本藥典中，采用抗生素微生物檢定法進行測定制劑中制霉菌素含量。上述藥典中，檢測制霉菌素含量雖有使用HPLC法，但僅用測得色譜圖計算制霉菌素A1的比例，制霉菌素含量仍需結(jié)合微生物檢測結(jié)果進行計算。制劑中制霉菌素含量測定方法研究目前市面上有較多制霉菌素相關(guān)藥物制劑，部分劑型的藥品質(zhì)量標準中制定了制霉菌素含量檢測方法。黃嵩等人REF_Ref30848\r\h[20]針對制霉菌素混懸劑制定了測定其制霉菌素含量的HPLC法，色譜條件中同樣采用C18色譜柱，305nm檢測，10μL進樣，但其根據(jù)劑型因素流動相更改為甲醇-N,N-二甲基甲酰胺-0.1M醋酸銨溶液（550：150：270）；后選效價測定法即制霉菌素的公認含量測定法，以管碟法測量抑菌圈直徑衡量抑菌效果為觀察目標，對其結(jié)果比對，得出結(jié)論，所建立的HPLC法符合要求，更值得點出的是，其方法省時省力、操作簡單。王婷等人REF_Ref30904\r\h[21]針對制霉菌素空腔糊劑制定了測定其制霉菌素含量的紫外分光光度法，以二甲亞砜為溶劑，在309nm處測定制霉菌素波長，該法在10~200U/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。高遠等人REF_Ref30966\r\h[22]針對制霉菌素甘油制劑制定了測定其制霉菌素含量的紫外分光光度法，以甲醇為溶劑，在304nm處測定吸光度A值，該法方便快速，重復(fù)性較好。唐錦心等人REF_Ref31015\r\h[23]針對制霉菌素口腔雙層貼膜劑型制定測定其制霉菌素含量的紫外分光光度法，同樣以甲醇為溶劑，在304nm處測定吸光度A值，制霉菌素在1.02～20.40μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。高章圈等人REF_Ref31057\r\h[24]針對制霉菌素膜劑制定測定其制霉菌素含量的分光光度法，同樣以甲醇為溶劑，但更改為在291nm處測定吸光度A值。蔡果REF_Ref31100\r\h[25]針對制霉菌素栓制定測定其制霉菌素含量的紫外分光光度法，同樣以甲醇作為溶劑，對其進行檢測，其檢測波長304nm，與吸光度之間至少在19.912~99.56mg/L的濃度范圍內(nèi)是良好的線性關(guān)系，其平均回收率達到了99.38%，RSD為1.50%。雖各國藥典中主要記載以微生物檢定法測定制霉菌素的含量，隨著制藥工藝的進步，所制的制霉菌素中制霉菌素A1純度越來越高，隨后多建立以紫外分光光度法為主的便捷準確的測定方法。但隨著近年來高效液相色譜法的推廣及普及，人們開始嘗試使用HPLC法測定制劑中制霉菌素的含量。研究內(nèi)容本研究旨在建立一種以制霉菌素標準品為對照，使用外標法測定硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素含量的高效液相色譜法，在研究探討以往的相關(guān)參考文獻后，優(yōu)化了對樣品提取方法、色譜條件等，從而建立一種高效、簡便的制霉菌素含量測定HPLC法，為硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素的測定奠定基礎(chǔ)。

材料與方法試劑表2-1試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家生產(chǎn)批號甲醇（色譜純）LiChrosolvI1204107213氫氧化鈉MACKLINC13060726氯化氫廣州牌化學(xué)試劑2020070930%過氧化氫廣州牌化學(xué)試劑20201202N,N-二甲基甲酰胺（色譜純）福晨化學(xué)20191030乙腈（色譜純）LiChrosolvJB127130乙酰胺(分析純）廣州牌化學(xué)試劑20171102制霉菌素標準品中國藥生物制品檢定研究所201802制霉菌素樣品/201501制霉菌素樣品/201601制霉菌素樣品/201602儀器表2-2儀器儀器名稱生產(chǎn)廠家型號穩(wěn)定性實驗箱天津藥典標準儀器廠WD-1恒溫水浴搖床ChomtronSW22熒光檢測燈CAMAGUV-CABINETⅡ超純水發(fā)生器MILLIPOREMiliQReference電子天平（1/十萬）SARTORIUSCP225D高效液相色譜儀Agilent1200Series/G1311A四元泵高效液相色譜儀Agilent1260ALS/G1311C高效液相色譜儀WATERSE2495/四元泵色譜柱ECOSILC185μm4.6*250mm色譜柱XtimateC185μm4.6*250mm色譜柱GLSciencesC185μm4.6*250mm渦流混合器JOANLAB1220超聲波清洗器BRANSONICN8800H-C方法色譜條件色譜柱ECOSILC18(4.6*250mm，5μm)，流動相A溶液為0.38%乙酸銨溶液-乙腈（71：29），流動相B溶液為0.38%乙酸銨溶液-乙腈（40：60）；柱溫控制為35℃；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為305nm，進樣量為10μL，流速為1.5mL/min，線性梯度洗脫。表2-3梯度洗脫時間（min)流動相A（%）流動相B（%）01000351000500100600100651000701000溶液的制備2.3.2.1流動相的制備稱取3.8g的乙酸銨，加入1L的超純水，攪拌均勻，后將超聲5~10min使其完全溶解，即為0.38%乙酸銨溶液。取710mL0.38%乙酸銨溶液，加入290mL乙腈，配制為流動相A溶液。取400mL0.38%乙酸銨溶液，加入600mL乙腈，配制為流動相B溶液。2.3.2.2制霉菌素標準品溶液的制備取10mg制霉菌素標準品，精密稱定，置于25mL量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺配制成0.4mg/mL的制霉菌素標準品溶液。2.3.2.3供試品溶液的制備精密稱取硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中內(nèi)容物0.86g于三角燒瓶中，加入約25mL的N,N-二甲基甲酰胺，封口后采用振搖儀器振搖15min至樣品基本溶解，后采用低溫超聲的方式使其完全溶解，大約超聲5min；溶解后將溶解液轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，使用約20mLN,N-二甲基甲酰胺分3~4次洗滌三角燒瓶內(nèi)部，洗滌液合并入量瓶中，再加N,N-二甲基甲酰胺至量瓶刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即為含有制霉菌素約0.4mg/mL的供試品溶液。

方法學(xué)驗證系統(tǒng)適用性試驗取制霉菌素標準品約10mg于25mL量瓶中，加入12.5mL甲醇，振搖至其完全溶解，再加水稀釋至量瓶刻度；取此溶液5mL，加入1mL稀鹽酸，混勻，置于室溫下20min后，取10μL注入高效液相色譜儀，根據(jù)2.3.1色譜條件將色譜圖記錄完整，進行圖譜分析，14min~35min內(nèi)的兩主峰分離度應(yīng)不小于3.5。線性關(guān)系考察共配制了6個系列濃度，取制霉菌素標準品5mg，精密稱定，置于5mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液①；取一個5mL量瓶，精密量?、?mL加入量瓶，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，作為對照品溶液②；精密量?、?.5mL于5mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，作為對照品溶液③；精密量?、?.5mL于5mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，作為對照品溶液④；精密量取④2.5mL于5mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，作為對照品溶液⑤；精密量?、?mL于5mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，作為對照品溶液⑥；以上6份對照品溶液濃度分別為1.0mg/mL，0.8mg/mL，0.4mg/mL，0.2mg/mL，0.1mg/mL，0.04mg/mL，分別進樣10μL，根據(jù)2.3.1色譜條件，記錄以上6份溶液的色譜圖及峰面積。其中，以制霉菌素峰面積（A）對標準品溶液的質(zhì)量濃度（c）制作線性回歸曲線，分析A與c的線性關(guān)系。穩(wěn)定性試驗取供試品（批號為210602）按上述供試品溶液方法制備，在10℃環(huán)境放置0min，70min，140min，210min，280min，350min，分別進樣10μL，根據(jù)2.3.1色譜條件將色譜圖完善記錄，以制霉菌素峰面積為觀察對象考察溶液變化情況。取供試品（批號為210602）按上述供試品溶液方法制備，在室溫環(huán)境下放置0min，70min，140min，210min，280min，350min，分別進樣10μL，按照2.3.1色譜條件進行分析，記錄各份供試品溶液的色譜圖，根據(jù)測得的色譜圖中制霉菌素峰面積考察溶液變化情況。重復(fù)性試驗平行稱取6份供試品（批號：210501），按照上述方式配制，每份溶液連續(xù)進樣2次，每次進樣10μL，同樣以2.3.1色譜條件為根據(jù)，記錄色譜圖，以制霉菌素峰面積與溶液濃度計算重復(fù)性RSD%。中間精密度試驗為了確定所用儀器在相同色譜條件下多次測定結(jié)果的重現(xiàn)性，試驗選用了高效液相色譜儀Agilent（1200Series/G1311A四元泵）+色譜柱GLSciencesC18(4.6*250mm,5μm)、高效液相色譜儀Agilent（1260ALS/G1311C）+色譜柱XtimateC18(4.6*250mm,5μm)、③高效液相色譜儀Agilent（1200Series/G1311A四元泵）+色譜柱ECOSILC18(4.6*250mm,5μm)，對供試品進行深入考察。量取供試品溶液（批號：210501）和標準品溶液各兩份，均取適量溶液注入以上三臺高效液相色譜儀，每份溶液進樣2次，每次進樣10μL，根據(jù)2.3.1色譜條件進行實驗分析，并記錄色譜圖，計算測定的樣品中制霉菌素含量的相對標準偏差。專屬性試驗①專屬性標準品溶液的制備：取2mg制霉菌素標準品，精密稱定，置于5mL量瓶中，加入2.5mg甲醇溶解，再加水至量瓶刻度線，搖勻制得含有制霉菌素標準品0.4mg/mL的溶液，作為專屬性標準品溶液。②空白對照溶液的制備：取一干凈的5mL量瓶，精密稱取0.86mg空白輔料置于量瓶中，加入2.5mL甲醇溶解完全，再加水至刻度，搖勻后濾過，取續(xù)濾液作為空白對照溶液。③陰性對照溶液的制備：精密量取2mL空白對照溶液，加入0.4mL的稀鹽酸，室溫放置20min以上，即為陰性對照溶液。④酸性條件破壞溶液的制備：取1mL專屬性標準品溶液，加入稀鹽酸，作為酸性條件破壞溶液。⑤堿性條件破壞溶液的制備：在1mL專屬性標準品溶液中加入0.2mLNaOH溶液，于室溫條件下放置30min，作為堿性條件破壞溶液。⑥高溫條件破壞溶液的制備：取1mL專屬性標準品溶液，在60℃條件下放置30min，作為高溫條件破壞溶液。⑦紫外條件破壞溶液的制備：取1mL專屬性標準品溶液，放置在紫外254nm的條件下，時間為18h，將其作為紫外條件破壞溶液。⑧光照條件破壞溶液的制備：取1mL專屬性標準品溶液，自然光照條件下放置18h，作為光照條件破壞溶液。⑨氧化條件破壞溶液的制備：取1mL專屬性標準品溶液，后向其加入0.2mL3%H2O2溶液，室溫環(huán)境中放置90min，作為氧化條件破壞溶液。上述9份不同破壞條件的溶液依次進樣，以2.3.1色譜條件為基礎(chǔ)進行進行分析研究，記錄色譜圖，觀察不同破壞條件下色譜圖中制霉菌素峰的變化?；厥章蕦嶒灳芊Q取制霉菌素標準品100mg于10mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺配制成10mg/mL的制霉菌素標準品溶液。精密稱取6份硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊（批號：210501）中內(nèi)容物0.43g于三角燒瓶中，精密量取1mL的10mg/mL的制霉菌素標準品溶液加入每份樣品，封口后采用振搖儀器振搖15min至樣品幾乎溶解，后超聲5min使其溶解完全；溶解后溶液轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，約20mLN,N-二甲基甲酰胺分三次洗滌三角燒瓶內(nèi)部，后將洗滌液合并入量瓶中，再加N,N-二甲基甲酰胺至刻度，配置成含有制霉菌素約0.4mg/mL的加標回收溶液。以上6份加標回收溶液按順序進樣，并以2.3.1色譜條件為基礎(chǔ)進一步分析研究，記錄色譜圖，計算投入量與測得量的回收率。

結(jié)果與分析系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果試驗結(jié)果見圖2。在18min-24min內(nèi)兩主峰分離度為3.5，方法的分離度較好。圖2制霉菌素含量測定系統(tǒng)適用性圖線性關(guān)系考察結(jié)果標準曲線如圖4-2所示，以制霉菌素標準品濃度（mg/mL）作為橫坐標，制霉菌素峰面積作為縱坐標，用最小二乘法的方式對A和c做線性回歸，制霉菌素峰面積與標準品濃度兩者之間呈線性關(guān)系，其回歸方程為y=19291397.2177x-50006.8222，相關(guān)系數(shù)為R2=1.0000，以上數(shù)據(jù)表明制霉菌素在0.04~1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。圖4-2制霉菌素標準品線性關(guān)系圖穩(wěn)定性試驗結(jié)果試驗結(jié)果如表4-3-1和表4-3-2所示，硝呋太爾制霉菌素軟膠囊內(nèi)容物中制霉菌素供試品溶液在低溫下放置6h內(nèi)和在室溫下放置6h內(nèi)峰面積均未發(fā)生明顯變化，制霉菌素在N,N-二甲基甲酰胺溶解的溶液情況下較穩(wěn)定，RSD均小于2.0%，表明制霉菌素供試品溶液穩(wěn)定性良好。表4-3-1供試品溶液在低溫條件下的穩(wěn)定性時間（min）峰面積RSD(%)089962340.397090901801409030866210908141028090689383509039507表4-3-2供試品溶液在室溫條件下的穩(wěn)定性時間（min）峰面積RSD(%)089307861.047087932411408739659210879541428086978153508677731重復(fù)性試驗結(jié)果重復(fù)性結(jié)果如表4-4所示，供試品（批號：210501）中制霉菌素含量在125.64%~132.18%之間，平均含量為128.82%，相對標準偏差為1.89%，符合《中國藥典》中的規(guī)定。表4-4重復(fù)性試驗結(jié)果序號取樣量（g）含量%含量RSD%10.8435127.911.8920.8484127.6230.8938128.3240.8675131.2250.8735132.1860.8599125.64中間精密度試驗結(jié)果中間精密度結(jié)果如表4-5所示，在采用了相同的色譜條件和相同色譜柱型號的情況下，將同一批樣品放置在有儀器差異的高效液相色譜儀和色譜柱中進行制霉菌素的含量測量，測得樣品中制霉菌素的平均含量分別為129.28%、128.58%、126.71%，相對標準偏差為1.03%，遵循了《中國藥典》中的規(guī)定。表4-5中間精密度實驗結(jié)果序號平均含量%平均含量RSD%①129.281.03②128.58③126.71專屬性試驗結(jié)果專屬性結(jié)果見圖3-圖11。圖3專屬性標準品溶液色譜圖圖4空白對照溶液色譜圖圖5陰性對照溶液色譜圖圖6酸性條件破壞溶液色譜圖圖7堿性條件破壞溶液色譜圖圖8高溫條件破壞溶液色譜圖圖9紫外條件破壞溶液色譜圖圖10光照條件破壞溶液色譜圖圖11氧化條件破壞溶液色譜圖具體試驗結(jié)果表明，本次樣品制劑中的輔料和實驗所用的溶劑對制霉菌素的含量測定均無干擾，本研究設(shè)定的色譜條件下，制霉菌素在不同臨界條件下能較好地分離制霉菌素分解產(chǎn)物及其他未知雜質(zhì)，所以方法專屬性良好?；厥章试囼灲Y(jié)果在擬定方法下測定的制霉菌素的回收率在93.02%~97.49%之間，平均回收濃度為95.46%，相對標準偏差為1.74%，符合《中國藥典》中的規(guī)定。表4-7加標回收率結(jié)果樣品稱重（g）樣品中制霉菌素（mg）標準品加入量（mg)檢出量（mg）回收率%平均回收率%回收率RSD%0.433312.879.6121.7596.7695.461.740.444313.2022.2497.490.439713.0621.6395.420.413412.2820.6094.120.423012.5720.6393.020.454913.5122.1995.95方法學(xué)驗證結(jié)果上述方法學(xué)驗證試驗結(jié)果表明，此方法可以測定硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中的制霉菌素含量，方法可行。

樣品的含量測定溶液的配制供試品溶液：精密稱取批號210501，210601，210602的硝呋太爾制霉菌素軟膠囊中內(nèi)容物0.86g，各稱取2份，按2.3.2.3方式配制成6份供試品溶液。對照品溶液：精密稱取2份20mg制霉菌素標準品，分別置于2個50mL量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺混合均勻，配制成2份0.4mg/mL的制霉菌素標準品溶液。測定方法取5.1中溶液，每份連續(xù)進樣2次，每次進樣10μL，根據(jù)2.3.1色譜條件進樣測定，并記錄每份溶液所測得的色譜圖。以色譜圖中數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，使用外標法公式，以各批樣品中制霉菌素峰面積計算其含量。測定結(jié)果實驗結(jié)果見表5-1，3批硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中的制霉菌素含量分別為127.76%、130.05%、130.94%，含量的相對標準偏差分別為0.16%、0.41%、0.40%。表5-1不同批次硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中的制霉菌素含量名稱稱重(g)平均峰面積含量%平均含量%含量RSD%批號：2105010.84359282969127.91127.760.160.84849315329127.62批號：2106010.86459701700130.43130.050.410.87519763278129.67批號：2106020.84229514532131.30130.940.400.87309807407130.57討論討論本研究測定的制霉菌素含量并非純物質(zhì)含量，而是制劑的百分標示量，上述數(shù)據(jù)符合藥典要求。因為硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊制劑中添加了較多的油性基質(zhì)輔料，所以在色譜柱前添加了預(yù)柱以保護色譜柱性能。由于樣品中輔料過多，且存有較多油性基質(zhì)，使樣品完全溶解較為困難。最初嘗試超聲30min使其溶解，但測試分次溶解樣品的制霉菌素含量相差較大，考慮超聲時間過長，會破壞樣品中部分制霉菌素。后采用振搖與低溫超聲聯(lián)合方式提取，取適量樣品置于三角燒瓶中，加入最終溶解樣品的一半量的溶劑，先振搖至樣品基本溶解，后將其進行短暫低溫超聲處理，至樣品完全溶解，其中內(nèi)容物所含有的油狀基質(zhì)在溶液中呈現(xiàn)透明無色的油滴狀態(tài)即為提取完全，再將溶解液轉(zhuǎn)移至量瓶中，用溶劑少量多次得洗滌三角燒瓶，并將每次洗滌液合并入量瓶內(nèi)，最終用溶劑定容并混合均勻。此操作測定可保證制霉菌素提取完全，并重復(fù)性良好。雖有轉(zhuǎn)移溶解液操作的部分損失，但對測定結(jié)果影響較小。制霉菌素為多組分混合物，但本實驗主要以制霉菌素中主組成成分制霉菌素A1為測定對象，測試結(jié)果與樣品效價測試結(jié)果接近，本實驗可為硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素含量的高效液相色譜法測定提供實驗數(shù)據(jù)支持。小結(jié)本研究采用較科學(xué)、合理的方法學(xué)驗證了硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素含量測定的高效液相色譜法，同時進行了對其系統(tǒng)適用性的分析研究，表明本測定方法系統(tǒng)適用性好，專屬性強，分離度達到藥典要求；制霉菌素標準品溶液在0.04mg/mL~1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；重復(fù)性RSD為1.89%，重復(fù)性良好；回收率為95.46%，RSD為1.74%，回收率良好。本研究制定的硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素含量測定的高效液相色譜法，方法可行，可以為硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊的質(zhì)量控制提供更方便準確的檢測方法。

結(jié)論本研究建立了硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素含量測定的高效液相色譜法，采用振蕩加低溫超聲的方式對硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊內(nèi)容物進行提取。色譜條件：色譜柱：ECOSILC18(4.6*250mm，5μm)，流動相A溶液為0.38%乙酸銨溶液-乙腈（71：29），流動相B溶液為0.38%乙酸銨溶液-乙腈（40：60），線性梯度洗脫；流速1.5mL/min；柱溫控制為35℃；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為305nm，進樣量為10μL，運行時間約70min。本實驗通過了優(yōu)化色譜條件，硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素含量測定的專屬性好，輔料空白對色譜峰保留時間無干擾影響；重復(fù)性較好；中間精密度較好；制霉菌素濃度再0.04mg/mL~1.0mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好；方法的回收率為93.02%~97.49%，相對標準偏差為1.74%。硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊中制霉菌素含量測定的高效液相色譜法，方法可行，可以為硝呋太爾制霉菌素陰道軟膠囊的質(zhì)量控制提供更方便準確的檢測方法。

參考文獻陳水英.硝呋太爾制霉素陰道軟膠囊治療門診陰道炎患者的效果[J].臨床合理用藥雜志,2022,15(35):112-115.DOI:10.15887/j.cnki.13-1389/r.2022.35.035.HaberL,王仕農(nóng).雷切爾·布朗和制霉菌素的發(fā)現(xiàn)[J].世界科學(xué),1985(07):56+64.TahseenH.Nastil,MasoodA.Khan,M.Owais.EnhancedefficacyofPH-sensitiveNYTliposomesagainstCryptococcusneoformansinmurinemodel[J].JournalofAntimicrobialChemotherapy2006,57:349-352.SzomekM,ReinholdtP,PetersenD,etal.Directobservationofnystatinbindingtotheplasmamembraneoflivingcells[J].BiochimBiophysActaBiomembr,2021,1863(2):183528.馬劍文,劉玉波,文德秀,等.高效液相色譜法研究國內(nèi)外制霉菌素的組成[J].藥學(xué)學(xué)報,1985,20(4):294-300.凌大奎,