YL膠囊溶出度試驗方法的初步研究

YL膠囊溶出度試驗方法的初步研究【摘要】目的：建立YL膠囊溶出度試驗方法，為其質(zhì)量評價提供參考。方法：采用小杯法，模擬胃液的溶出介質(zhì)為0.1mol/L鹽酸溶液100mL，模擬腸液的溶出介質(zhì)為pH=6.8的磷酸鹽緩沖液100mL，轉(zhuǎn)速50r·min-1，溫度37±0.5℃進(jìn)行溶出度試驗，溶出液經(jīng)孔徑10μm的濾膜濾過，用紫外分光光度計測定其600nm處的吸光度。結(jié)果：YL高濃度膠囊在胃液中無溶出，在腸液中完全溶出。結(jié)論：試驗結(jié)果可為YL膠囊的質(zhì)量評價提供參考，保證藥物的質(zhì)量?！娟P(guān)鍵詞】YL膠囊；溶出度；比濁法；CCK-8；活菌數(shù)PreliminaryStudyonDissolutionMethodofYLCapsules[Abstract]Objective:ToestablishamethodofthedeterminationofthedissolutionofYLcapsules,thus,toprovidereferenceforitsqualityevaluation.Methods:Thesmallglassmethodwasadoptedfortwodifferentdissolutionmedia,thedissolutionmediumofsimulatedgastricfluidwas100mLof0.1mol/Lhydrochloricacidsolution,andthedissolutionmediumofsimulatedintestinalfluidwas100mLofphosphatebufferwithpH=6.8,therotationspeedwas50r·min-1,andthetemperaturewas37±0.5℃.Thedissolutionwasfilteredthroughafiltermembranewithaporesizeof10μm。Itsabsorbanceat600nmwasdeterminedbyanultravioletspectrophotometer.Results:TheHighconcentrationofYLcapsulesdonotdissolveingastricjuice,whiletotaldissolveinintestinalfluid.Conclusion:TheexperimentalresultscanprovideareferenceforthequalityevaluationofYLcapsulesandensurethequalityofdrugs.[Keywords]YLCapsulesDissolutionTurbidimetricmethodCellCountingKit-8Numberofviablebacteria目錄TOC\o"1-3"\h\u1前言 前言1.1益生菌的藥理作用、臨床作用及發(fā)展現(xiàn)狀YL膠囊是一種自研的活菌膠囊，其主要的藥物為益生菌。益生菌是一種腸道的共生菌群，其主要作用是調(diào)整人體免疫和腸道等健康，是目前用于調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的常見制劑產(chǎn)品。近年來微生物組學(xué)的研究不斷深入，越來越多的研究證據(jù)顯示微生物與人體的健康密切相關(guān)，人類生活質(zhì)量的不斷提高，促使益生菌制劑產(chǎn)品也逐漸走在高科技生物制品的前沿。對于日漸發(fā)展的益生菌制劑產(chǎn)品，確認(rèn)其活菌數(shù)是確保產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。為了滿足科研部門和醫(yī)院測定工作的需要，國內(nèi)外在益生菌制劑的研究上給予更多的關(guān)注以及不斷深入探究。1.2溶出度試驗的發(fā)展現(xiàn)狀在藥物產(chǎn)品的開發(fā)階段或常規(guī)的質(zhì)量控制階段,溶出度試驗以反映和控制藥物制劑的體內(nèi)溶出行為為目的REF_Ref28207\n\h[1]，因此溶出方法都應(yīng)盡可能建立良好的體內(nèi)外相關(guān)性，才能較為準(zhǔn)確地預(yù)測該藥物在體內(nèi)的吸收行為。美國藥典是最早收載有關(guān)溶出度試驗的藥典，于1973年版美國藥典收載地高辛片的溶出度和釋放度檢查，第一次引入溶出度檢查的相關(guān)概念，隨后在1988年正式引入溶出度檢查法。而溶出度試驗最初以溶出檢查法在1985年被收錄入中國藥典，在1995年新增了小杯法裝置，至最新版中國藥典2020年版，收錄了籃法、漿法、小杯法、槳碟法、轉(zhuǎn)筒法、流池法以及往復(fù)筒法，共七種測定方法。目前中國藥典溶出度檢查品種數(shù)達(dá)180種，美國藥典則高達(dá)515種REF_Ref28296\n\h[2]。橫觀國內(nèi)外，美國藥典是目前收錄溶出度試驗方法最多且各方面最詳盡的藥典?？v觀整個溶出度試驗方法發(fā)展歷程，國內(nèi)外不斷新增溶出度試驗方法，不斷優(yōu)化與完善現(xiàn)存的方法，要求越來越嚴(yán)格，可見溶出度試驗對藥物的質(zhì)量保證越來越重要。目前各國藥典關(guān)于藥物溶出檢查的政策和規(guī)定不盡相同,但總體趨勢向著趨于統(tǒng)一的方向發(fā)展REF_Ref28397\n\h[3]。如今，相對前沿的方法如往復(fù)筒法、流通池法，基于介質(zhì)的自然對流，使樣品一直暴露于均勻無渦流的新鮮介質(zhì)中，從而達(dá)到模擬藥物體內(nèi)溶出的效果。在一定程度為一般口服藥物的質(zhì)量評價提供參考，但裝置以及操作步驟較為復(fù)雜，且有待改進(jìn)與完善。而籃法和小杯法等作為較常用的溶出度試驗方法，以攪拌或旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強(qiáng)制對流使藥物溶出為原理REF_Ref28433\n\h[4]，其裝置簡單、操作簡單，同樣能建立良好的體內(nèi)外相關(guān)性，故更加多地應(yīng)用于藥物溶出檢查中。盡管當(dāng)前各國還沒有關(guān)于溶出方法建立與驗證的詳盡指導(dǎo)與解釋，但是通常在藥物溶出方法建立過程中首選籃法與漿法，在兩者不適用時，才考慮采用往復(fù)筒法或流通池法等REF_Ref28465\n\h[5]。1.3活菌數(shù)測定方法的發(fā)展現(xiàn)狀1.3.1平板菌落計數(shù)法作為一種傳統(tǒng)的總菌數(shù)的測定方法，平板菌落計數(shù)法是取合適稀釋度的菌液，滴入選擇性瓊脂培養(yǎng)基平皿上，玻棒涂布均勻后置適宜條件下培養(yǎng)，到期對平皿菌落進(jìn)行計數(shù)REF_Ref28576\n\h[6]。該法能準(zhǔn)確地測定出相應(yīng)實驗結(jié)果，故被廣泛應(yīng)用且多作為其他方法的驗證方法。但時由于其檢測過程中多因操作過程繁瑣，檢測周期長，容易導(dǎo)致測定結(jié)果受多種試驗因素(如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基等)的影響。1.3.2比濁法比濁法也是一種傳統(tǒng)、常見的總菌數(shù)的測定方法，其原理是利用微生物液體培養(yǎng)后因活菌的增加，導(dǎo)致培養(yǎng)液渾濁度的增加，進(jìn)而運(yùn)用分光光度計在特定波長下測定REF_Ref28622\n\h[7]，進(jìn)行渾濁度的對比。該方法優(yōu)點(diǎn)在于簡單、快速且直觀，但無法確定培養(yǎng)液中菌的死活，故測出的數(shù)據(jù)不能準(zhǔn)確地表明微生物的活菌數(shù)。1.3.3流式細(xì)胞分析技術(shù)（FCM）流式細(xì)胞分析技術(shù)（flowcytometryanalysisFCM）是近年來在非培養(yǎng)活菌定量技術(shù)中迅速崛起的一項技術(shù)，其原理基于SYTO9和PI兩種核酸染料的跨膜特性進(jìn)行益生菌死/活的區(qū)分，染色后孵育，使用nFCM檢測，實現(xiàn)對細(xì)菌活性的評估。該法提供了一種極其快速且準(zhǔn)確的單細(xì)胞計數(shù)細(xì)菌檢測方法REF_Ref28655\n\h[8]，且其結(jié)果的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性以及重復(fù)性較高，現(xiàn)已被證實可用于益生菌產(chǎn)品總菌及活菌的計數(shù)，但目前該檢測技術(shù)很難實現(xiàn)每種菌的活菌計數(shù)REF_Ref28684\n\h[9]，而且裝置昂貴，測試條件苛刻，不易實現(xiàn)快速準(zhǔn)確地檢測活菌總數(shù)。1.3.4熒光法CalceinUltraGreen?AM是一種新型熒光染料，可用于標(biāo)記和監(jiān)測活細(xì)胞。該方法利用新型熒光染料的熒光特性及其在活細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的反應(yīng)特性，根據(jù)熒光染料的光譜特性測定其熒光強(qiáng)度值，建立熒光強(qiáng)度值與活菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。張宇婷REF_Ref28717\n\h[10]等用熒光法、比濁法、流式細(xì)胞計數(shù)法與平板計數(shù)法四種方法測定活菌數(shù)，實驗表明上述建立的熒光法檢測結(jié)果更接近于平板計數(shù)法的檢測結(jié)果，而且重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性更好。但由于該染色條件是用于染色動物細(xì)胞，目前應(yīng)用該染料檢測活菌數(shù)的相關(guān)文獻(xiàn)鮮有報道，技術(shù)的成熟性未得到驗證。1.3.5MTT法快速檢測技術(shù)噻唑藍(lán)[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoli-umromide，MTT]法，其原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性黃色的四甲基偶氮藍(lán)(MTT)還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，根據(jù)甲瓚生成量與活細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，測定相應(yīng)的OD值，從而間接獲得活細(xì)胞數(shù)量REF_Ref28759\n\h[11]。該法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、操作簡便、節(jié)省材料、無同位素污染，便于實驗室開展應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)REF_Ref28825\n\h[12]，從而可以用于大部分細(xì)菌以及部分益生菌的活菌測定，簡化操作過程的同時滿足大批量樣本的處理需求。但對于其他菌種，是否也適用MTT比色法還有待進(jìn)一步研究。該法還存在一個不足之處--存在濃度下限，當(dāng)菌體數(shù)量太低時，由于系統(tǒng)誤差造成的數(shù)據(jù)偏差相對于測定結(jié)果非常顯著，因而線性關(guān)系弱化，方法便不再適用REF_Ref28864\n\h[13]。1.3.6CCK-8法CCK-8法，CellCountingKit-8是一種較新型的活細(xì)胞計數(shù)方法。其原理類似與MTT法，CCK-8試劑被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，可直接進(jìn)行測定，且因CCK-8試劑生成的甲臢物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量呈正比，測定的OD值可以間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量REF_Ref28893\n\h[14]。相比于應(yīng)用廣泛的MTT法，CCK-8法存在著優(yōu)勢：生成的可溶性甲臜可以直接測定，操作更加方便快捷且安全；孵育時間較MTT法短，更加省時；目前已有實驗REF_Ref28916\n\h[15]證明CCK-8法重復(fù)性好、靈敏度高，明顯優(yōu)于MTT法。但此法尚未在活性菌增殖或藥物篩選中應(yīng)用，故可以在不斷改進(jìn)和完善該方法下嘗試采用其對活菌數(shù)量進(jìn)行測定。1.3.7小結(jié)對于微生物制劑的質(zhì)量控制上，建立一種操作簡單、快速、準(zhǔn)確并可反映細(xì)菌活性的細(xì)菌計數(shù)方法是非常必要的，故才不斷出現(xiàn)如以上所述的各種創(chuàng)新方法。對比其余幾種方法，比濁法操作相較于簡單便捷，但測定結(jié)果沒有其他儀器法準(zhǔn)確；流式細(xì)胞技術(shù)、熒光法、MTT法和CCK-8法都是基于試劑染色或者與細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生有色的產(chǎn)物來進(jìn)行測定，流式細(xì)胞技術(shù)和MTT法都擁有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，但這兩種方法所使用的儀器設(shè)備價格高，相比之下，CCK-8法不僅準(zhǔn)確度較高，而且成本低，操作簡單。故本文選取了比濁法和CCK-8法對YL膠囊進(jìn)行溶出度試驗，旨在選出較為適宜該藥物的溶出度試驗方法。2材料與儀器2.1儀器見表1。表1實驗儀器儀器型號生產(chǎn)廠家藥物溶出度儀RCZ-8上海黃海藥檢儀器有限公司酶標(biāo)儀synergyHT美國伯騰儀器有限公司pH計FiveEasyPlusMETTLERTOLEDO公司集團(tuán)細(xì)胞培養(yǎng)板TCP010096GuangzhouJetBio-FiltrationCo.超聲波清洗器SK720LHC上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司千分之一天平BS423S北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司紫外分光光度計UV-1800島津企業(yè)管理（中國）有限公司冰箱BCD-535WGHSSEDS9海爾智家股份有限公司微孔濾膜10μm上海興亞凈化材料廠2.2試劑與試藥見表2。表2實驗材料材料批號來源空白YL膠囊20230101廣東南芯醫(yī)療科技有限公司低濃度YL膠囊20230102廣東南芯醫(yī)療科技有限公司高濃度YL膠囊20230104廣東南芯醫(yī)療科技有限公司鹽酸（分析純）2021111123廣東廣試試劑科技有限公司磷酸三鈉（分析純）2020072073天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司CCK-8試劑MA0218-Nov-30H廣州瑞舒生物科技有限公司純水20230311廣州市屈臣氏食品飲料有限公司3方法3.1溶出介質(zhì)的制備3.1.1模擬胃液的溶出介質(zhì)0.1mol/L鹽酸溶液配制方法：量取9mL的濃鹽酸于燒杯中加入適量蒸餾水，用玻璃棒攪拌，使其混合均勻，待稀釋的鹽酸冷卻后，沿玻璃棒注入1000mL的量瓶中，加入蒸餾水至刻度線，搖勻即可。溶液使用前進(jìn)行15-20min的超聲，以除去氣泡。3.1.2模擬腸液的溶出介質(zhì)0.1mol/L鹽酸溶液配制方法：同3.1.1方法一致。0.2mol/L磷酸鈉溶液配制方法：精密稱取76.0248g磷酸三鈉于燒杯中加入適量蒸餾水，用玻璃棒攪拌，使其溶解。沿玻璃棒注入1000mL的容量瓶中，加入蒸餾水定容，搖勻。pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液配制方法：取0.1mol/L鹽酸溶液和0.2mol/L磷酸鈉溶液按3:1混合均勻，必要時用0.1mol/L鹽酸溶液和0.2mol/L磷酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，在37±0.5℃溫度下保存。使用前進(jìn)行15-20min的超聲，以除去氣泡。4溶出度試驗條件的考察4.1溶出度試驗方法的選擇取待測膠囊6粒，根據(jù)不同的方法分別放入六杯溶出杯中，設(shè)定不同溶出度試驗方法的條件，按儀器使用流程操作，對比膠囊在籃法和小杯法的溶出情況。由于膠囊為腸溶膠囊，需經(jīng)歷兩種不同的溶出介質(zhì)的溶出，觀察在酸中和緩沖液中的溶出情況。4.1.1籃法取待測膠囊6粒和空白膠囊1粒分別投進(jìn)轉(zhuǎn)籃中，照溶出度與釋放度測定法（中國藥典2020年版四部通則0931第一法）進(jìn)行溶出度試驗。分別量取規(guī)定量的0.1mol/L鹽酸溶液置各大溶出杯中，待溶出介質(zhì)溫度恒定在37±0.5℃，轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘100轉(zhuǎn)，啟動儀器，依法操作，經(jīng)2小時后取樣，吸取溶出液5mL于安瓿中，另外吸取溶出液5mL過濾后置于EP管中。按實驗設(shè)定的各方法測定，得出每粒的酸中溶出情況。上述各溶出杯酸液中加入溫度為37±0.5℃規(guī)定量的0.2mol/L磷酸鈉溶液，繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)60min，于140min、160min、180min取溶出液5mL于安瓿中，另外吸取溶出液5mL過濾后置于EP管中。按實驗設(shè)定的各方法測定，得到每粒的緩沖液中溶出情況。4.1.2小杯法取待測膠囊6粒和空白膠囊1粒分別放入沉降籃中，照溶出度與釋放度測定法（中國藥典2020年版四部通則0931第三法）進(jìn)行溶出度試驗。溶出介質(zhì)的體積可選用250ml或100ml。除另有規(guī)定外，分別量取規(guī)定量的0.1mol/L鹽酸溶液置各溶出杯內(nèi)，實際量取的體積與規(guī)定體積的偏差應(yīng)在±1%范圍之內(nèi)，待溶出介質(zhì)溫度恒定在37℃±0.5℃，取待測膠囊6粒分別投入溶出杯中，注意避免膠囊表面產(chǎn)生氣泡，立即按各品種項下規(guī)定的轉(zhuǎn)速50rpm啟動儀器，2小時后在規(guī)定取樣點(diǎn)吸取溶出液適量。按實驗設(shè)定的各方法測定，計算每粒的酸中溶出量。棄去上述各溶出杯中酸液，立即加入規(guī)定量的溫度為37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH=6.8），繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)60分鐘，更換使用玻棒進(jìn)行人工攪拌至藥物分散均勻，在規(guī)定取樣點(diǎn)吸取溶出液適量，經(jīng)孔徑10μm的濾膜濾過，自取樣至濾過應(yīng)在30秒內(nèi)完成。按實驗設(shè)定的各方法測定，計算每粒的緩沖液中溶出量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)籃法的溶出介質(zhì)體積較大導(dǎo)致測出的吸光度值較低，容易造成誤差大，不易得出相適應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時材料消耗較大。最后確定使用小杯法，濃度適宜。4.2介質(zhì)的選擇根據(jù)溶出度與釋放度測定法（中國藥典2020年版四部通則0931），腸溶制劑通常要進(jìn)行酸中溶出量和緩沖液中溶出量的測定，酸中溶出時使用的溶出介質(zhì)為了模擬胃液一般采用0.1mol/L的鹽酸溶液，緩沖液中溶出時使用的溶出介質(zhì)為了模擬腸液一般有兩種方式：①在原來酸液加入適量0.2mol/L的磷酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至6.8；②直接棄去原酸液，更換為相同體積的新鮮配制的pH=6.8的磷酸鹽緩沖液。本實驗采取的為后者，使用該溶出介質(zhì)具有操作簡便，誤差小，準(zhǔn)確高的特點(diǎn)。4.3介質(zhì)體積的選擇根據(jù)溶出度與釋放度測定法（中國藥典2020年版四部通則0931），漿法的溶出杯為1000ml杯狀容器，必要時溶出介質(zhì)可減少至500ml。小杯法的溶出杯則為250ml杯狀容器，通常溶出介質(zhì)體積采用250ml，必要時溶出介質(zhì)可減少至100ml。實驗對比高濃度膠囊于250ml和100ml體積的溶出介質(zhì)中的溶出情況，結(jié)果為于250ml的吸光度均值約0.158，于100ml的吸光度均值約0.355。表明采用100ml的溶出體積成本低，且測定數(shù)值在0.2-0.8范圍內(nèi)，測定較為準(zhǔn)確，故該溶出體積選用100ml。4.4CCK-8試劑加入量的選擇根據(jù)CCK-8試劑的使用說明書，為篩選出適宜的CCK-8試劑加入量，選取了三個不同試劑終濃度進(jìn)行對比。取單粒低濃度YL膠囊置于250ml37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）中，攪拌至完全溶出。按照以下三種方法對溶出液進(jìn)行操作：①吸取50μl的溶出液，加入100μl的稀釋10倍的CCK-8試劑，混勻，此時CCK-8試劑終濃度為6.66%；②吸取100μl的溶出液，加入50μl未稀釋的CCK-8試劑，混勻，此時CCK-8試劑終濃度為33.33%；③吸取100μl的溶出液，加入100μl未稀釋的CCK-8試劑，混勻，此時CCK-8試劑終濃度為50.00%。結(jié)果見表3。表3不同濃度的CCK-8放置不同時間的OD值CCK-8濃度6.66%33.33%50.00%0.5h0.0520.1790.1911h-0.1820.1941.5h-0.1850.1972h-0.1850.1993h-0.1890.20318h-0.2210.236由上表可見，CCK-8試劑終濃度在6.66%且放置半小時后，OD值低至0.051，故不采用方法①。而方法②和③結(jié)果顯示，兩種終濃度的OD值均大于0.100，易于測得，且CCK-8的終濃度從33.33%增大到50.00%其OD值增大不明顯，CCK-8試劑的加入劑量應(yīng)為33.33%。4.5酶標(biāo)儀測定波長的選擇根據(jù)CCK-8試劑的使用說明書，為篩選出適宜的測定波長，選取了三個不同波長進(jìn)行對比。取單粒高濃度YL膠囊置于250ml37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）中，攪拌至完全溶出。取5份100μl的溶出液，各加入50μl的CCK-8試劑，避光孵化1h后，考察450nm、562nm和600nm處的OD值。結(jié)果見圖4-1。圖4-1不同波長下測定高濃度膠囊的OD值由上圖可見，450nm處測得的OD值明顯比562nm和600nm處的OD值要大，即CCK-8試劑與活菌反應(yīng)產(chǎn)生的甲臜在450nm處測定敏感度最高，故選用450nm的波長測定。4.6孵化時間的選擇根據(jù)CCK-8試劑的使用說明書，為篩選出適宜的孵化時間，選取了六個不同時間進(jìn)行對比。取單粒低濃度YL膠囊置于250ml37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）中，攪拌至完全溶出。取100μl的溶出液，加入50μl的CCK-8試劑，避光孵化0.5h、1h、1.5h、2h、3h和18h后，在450nm處測定其OD值。結(jié)果見圖4-2。圖4-2加入CCK-8試劑后不同孵化時間的OD值由上圖可見，OD值隨著時間的增長而變大，在前3小時OD值與時間顯線性關(guān)系，基于CCK-8試劑的建議孵育時間2-4h，故選用3h作為孵育時間。4.7紫外分光光度計測定波長的選擇根據(jù)膠囊前期制備所提供的測定波長600nm，按照4.8.2對空白膠囊和高濃度膠囊的過濾后的溶出液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖4-3和圖4-4。結(jié)果顯示，在可見光波長400-760nm處，待測膠囊溶出液有明顯吸收值，而空白膠囊?guī)缀鯖]有吸收，故選擇600nm是合理的。4.8含量測定方法學(xué)驗證4.8.1專屬性試驗取1?？瞻啄z囊置于裝有100mL0.1mol/L鹽酸溶液的溶出杯中，1粒高濃度膠囊置于裝有100mL0.1mol/L鹽酸溶液的溶出杯中，以50rpm轉(zhuǎn)速，37℃的條件下溶出2h后更換相同體積的37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH6.8），繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)60分鐘，取其溶出液，經(jīng)孔徑10μm的濾膜濾過。以pH=6.8的磷酸鹽緩沖液作空白對照，對空白膠囊和高濃度膠囊的過濾后的溶出液進(jìn)行全波長掃描。結(jié)果見圖4-3、圖4-4。圖4-3膠囊溶出液的全波長掃描圖4-4膠囊溶出液的500-700nm處掃描由上圖可見，在600nm處，空白膠囊無明顯的吸收，而高濃度膠囊的吸光度值明顯比空白膠囊的值要大，表明空白膠囊在選用的波長上對含藥物的膠囊吸光度值無影響或不干擾。即可采用測定600nm處的波長對供試品膠囊進(jìn)行吸光度的測定。4.8.2穩(wěn)定性試驗根據(jù)4.1.2的方法，取一粒高濃度膠囊置于裝有100mL0.1mol/L鹽酸溶液的溶出杯中，以50rpm轉(zhuǎn)速，37±0.5℃的條件下溶出2h后更換相同體積的37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH6.8），繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)60分鐘，取其溶出液，經(jīng)孔徑10μm的濾膜濾過。測定藥物完全溶出后0h、18h和24h在600nm處的吸光度值。結(jié)果見圖4-5。圖4-5溶出液在不同時長600nm處的OD值由上圖可見，在0h、18h和24h三個時間點(diǎn)測定的吸光度值無太大的變化，即溶出后馬上測定以及放置一段時間后測定無明顯差別，且三者的RSD小于15.0%，表明該法測定在24h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。5測定方法的篩選5.1實驗原理5.1.1比濁法的實驗原理比濁法是測定總菌數(shù)常用而又比較簡便的方法，它的原理是在微生物液體培養(yǎng)以后，隨著活菌增多，培養(yǎng)液渾濁度也隨之升高，再利用分光光度計對某一特定波長進(jìn)行測REF_Ref28622\n\h[7]，測定值能在一定程度上反映菌數(shù)。5.1.2CCK-8法的實驗原理CCK-8法，CellCountingKit-8(CCK-8法)是一種較新型的活細(xì)胞計數(shù)方法。其原理類似與MTT法，CCK-8試劑被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，可直接進(jìn)行測定，且因CCK-8試劑生成的甲臢物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量呈正比，測定的OD值可以間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量REF_Ref28759\n\h[11]。5.2方法5.2.1比濁法的測定方法根據(jù)4.1中的小杯法，采用250ml溶出體積對空白YL膠囊和高濃度YL膠囊進(jìn)行溶出，取空白和不同濃度膠囊的不同時段的溶出液于96孔板中，在酶標(biāo)儀450nm處測定其OD值；或根據(jù)4.1中的小杯法，分別采用250ml和100ml的溶出體積對空白YL膠囊和高濃度YL膠囊進(jìn)行溶出，取120min、180min已過濾的溶出液，取空白和不同濃度膠囊的不同時段的溶出液于比色皿中，在紫外分光光度計下測定600nm處的OD值。5.2.2CCK-8法的測定方法根據(jù)4.1中的小杯法對單顆空白YL膠囊和單顆高濃度YL膠囊分別進(jìn)行溶出，取180min溶出液，用移液槍分別移取空白和不同濃度膠囊不同時段的溶出液各5份100μl于96孔板，分別加入50μl的CCK-8試劑，混勻，37℃避光孵育，于3h后在酶標(biāo)儀450nm處測定其OD值。5.3實驗結(jié)果5.3.1比濁法的測定結(jié)果根據(jù)5.2.1中的方法，在酶標(biāo)儀450nm處測定其OD值。結(jié)果見表4、表5。根據(jù)5.2.1中的方法，在紫外分光光度計的600nm處測定其OD值。溶出體積為250ml的結(jié)果見表6、表7;溶出體積為100ml的結(jié)果見表8、表9。表4120min溶出液的OD值空白123456OD10.0390.0390.0370.0390.0390.0400.039OD20.0390.0400.0370.0390.0400.0380.038OD30.0380.0390.0400.0380.0390.0380.039OD40.0390.0390.0360.0370.0400.0380.037OD50.0370.0380.0390.0360.0380.0370.036AVERAGE0.0380.0390.0380.0380.0390.0380.038RSD0.0230.0180.0430.0340.0210.0290.034減去空白-0.001-0.001-0.0010.0010.000-0.001表5180min溶出液的OD值空白123456OD10.0530.0550.0710.0560.0570.0640.057OD20.0500.0540.0530.0550.0580.0590.057OD30.0490.0540.0510.0550.0560.0590.058OD40.0480.0530.0530.0530.0560.0590.056OD50.0490.0510.0540.0530.0560.0570.058AVERAGE0.0490.0530.0560.0540.0570.0600.057RSD0.0390.0280.1500.0250.0160.0440.015減去空白-0.0040.0070.0050.0070.0100.007表6120min溶出液600nm處OD值123456OD10.0020.0000.0020.000-0.001-0.001OD20.0020.0000.0020.000-0.001-0.001OD30.0020.0000.0020.000-0.001-0.001EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)0.0020.0000.0020.000-0.001-0.001AVERAGE0.000表7180min溶出液600nm處OD值123456OD10.1740.1470.1580.1410.1440.187OD20.1740.1470.1570.1410.1440.188OD30.1740.1470.1560.1420.1440.188EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)0.1740.1470.1570.1410.1440.187AVERAGE0.158STDEV0.018RSD11.7%表8120min溶出液600nm處OD值123456OD1-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000OD2-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000OD3-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000AVERAGE0.000表9180min溶出液600nm處OD值123456OD10.4020.3880.3150.3980.3320.296OD20.4020.3890.3150.3970.3330.295OD30.4020.3900.3150.3970.3340.295EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)0.4020.3890.3150.3970.3330.296AVERAGE0.355STDEV0.046RSD13.0%結(jié)果可知，在酶標(biāo)儀下測定溶出液的OD值均非常小，其結(jié)果無法準(zhǔn)確地表明溶出液的渾濁程度，故不使用該法。而使用紫外分光光度法，在模擬胃液的2h內(nèi)，待測膠囊無論在250ml或100ml溶出介質(zhì)中進(jìn)行溶出，其溶出液在600nm處基本無吸收，即表明YL膠囊在胃的環(huán)境下不溶出；在模擬腸液的1h內(nèi)，膠囊殼變形、破裂，逐漸溶解，暴露出內(nèi)容物，溶液逐漸變渾濁。溶出液在600nm處有吸收，且溶出體積越小吸光度值越大，即表明YL膠囊在腸的環(huán)境下完全溶出，六杯溶出液的RSD＜15%，證明其重復(fù)性較好，故可以采用該儀器法對溶出液進(jìn)行測定。5.3.2CCK-8法的測定結(jié)果根據(jù)5.2.2測定溶出液在450nm處的OD值。結(jié)果見表10。表10180min溶出液450nm測定OD值編號空白高濃度對照10.0770.1890.07320.0810.1860.07530.1020.2270.07740.1520.251-50.1630.218-AVERAGE0.1150.2140.075結(jié)果可知，在模擬腸液的1h內(nèi)，膠囊逐漸崩解，取180min溶出液與CCK-8反應(yīng)，溶液從淺粉色經(jīng)避光孵育后呈棕黃色，在450nm處有較大的OD值，即表明YL膠囊在腸液的環(huán)境下溶出且溶出液中存在活菌。6討論溶出介質(zhì)是溶出度試驗的其中一個重要要素，溶出介質(zhì)的pH值影響藥物的溶出效果。實驗選取如4.2所述的兩種不同方法制備模擬腸液，方法①在溶出杯中直接按比例混合鹽酸與磷酸鈉溶液，無法保證讓平行六杯溶出杯中的溶液同時達(dá)到pH=6.8，且操作繁雜，容易造成誤差。相比之下方法②，使用當(dāng)天新鮮配制的pH=6.8的磷酸鹽緩沖液，操作較為簡便，確保溶出杯中的溶液相同，能在一定程度降低在更換溶出液時的誤差。在進(jìn)行CCK-8法染色時，試劑的濃度是影響顯色的一個因素。設(shè)定三個三個試劑終濃度，調(diào)整其加入量。CCK-8試劑終濃度在6.66%時，OD值非常低，推測此時CCK-8濃度太低，試劑與細(xì)胞反應(yīng)不充分，以致難以顯色；當(dāng)CCK-8試劑終濃度在33.33%時，OD值大于0.1，顯色明顯。但為確保該濃度下CCK-8未飽和，將CCK-8終濃度加大到50.00%，可見OD值增加不明顯，即表明在終濃度為33.33%時CCK-8試劑不存在飽和現(xiàn)象，且為了節(jié)省成本，最終確定CCK-8試劑的加入量為50μl。在進(jìn)行吸光度值測定時，直接用紫外分光光度計測定其OD值，或用酶標(biāo)儀直接測定其OD值，發(fā)現(xiàn)空白膠囊的值較低濃度的值大，推測空白膠囊和待測膠囊的輔料自身存在吸光度值，會對測定產(chǎn)生一定的干擾。為除去輔料的干擾，相關(guān)研究人員使用孔徑為0.45、2、5、10μm的濾膜對溶出液進(jìn)行過濾，綜合實驗數(shù)據(jù)，可以得到濾紙孔徑大于5μm，并不會造成活菌數(shù)停留在濾膜上，活菌的通過率達(dá)100%，而輔料中其他較大顆粒會因為濾紙孔徑被吸付著。故本實驗采用10μm的濾膜以消除自身輔料對測定的干擾。YL膠囊的紫外分光光度計測定中，實驗建立的CCK-8法和比濁法均能表現(xiàn)YL膠囊的溶出情況?；趯嶒灲Y(jié)果，對比兩種方法，CCK-8相對于比濁法操作更加復(fù)雜，耗時相對較長，且成本相對較高，所以選擇了后者。本實驗僅初步建立了YL膠囊的溶出度試驗的方法，實驗結(jié)果并不能直接呈現(xiàn)溶出度及其溶出的活菌數(shù)。但有相關(guān)人員研究選取OD值范圍在0.1-1.0間的YL菌液，進(jìn)行稀釋涂布，統(tǒng)計平板菌落計數(shù)結(jié)果，進(jìn)一步深入研究得出YL菌液的OD值在0.1~1.0的范圍內(nèi)，其OD值與對應(yīng)的活菌數(shù)的相關(guān)性呈線性關(guān)系，其關(guān)系表現(xiàn)為：Y=14.216*X-1.6136(單位每毫升活菌數(shù)為10^8CPU/mL)，即隨著OD值的增大，其對應(yīng)的活菌數(shù)也升高。OD值與活菌數(shù)之間的關(guān)系考察，說明了本實驗確立的比濁法的可行性與準(zhǔn)確性?？筛鶕?jù)該考察，進(jìn)一步完善YL膠囊的溶出度試驗及其含量測定方法，補(bǔ)充相應(yīng)的方法學(xué)考察后，可以將其應(yīng)用于大批量膠囊的溶出度試驗，為YL膠囊的質(zhì)量評價提供參考，保證藥物的質(zhì)量。7結(jié)論7.1體外溶出試驗通過對溶出度試驗條件的篩選，適合YL膠囊溶出度試驗的方法為：以0.1mol/L鹽酸溶液100mL作模擬胃液，以pH=6.8的磷酸鹽緩沖液100mL作模擬