AccQ-Tag法測(cè)定依替巴肽的氨基酸比值

AccQ—Tag法測(cè)定依替巴肽的氨基酸比值目的：建立反相色譜法測(cè)定依替巴肽的氨基酸比值。方法：采用以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯（AQC）輿各氨基酸柱前定量衍生后，經(jīng)反相色譜測(cè)定。結(jié)果：在范圍內(nèi)各氨基酸的線性關(guān)系良好，精密度，溶液穩(wěn)定性，回收率均良好。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，易于操作，可用于依替巴肽中氨基酸組成的測(cè)定。標(biāo)簽：AccQ-Tag；依替巴肽；氨基酸比值A(chǔ)BSTRACTOBJECTIVE：ToestablishanHPLCmethodfordeterminationofAminoacidratioineptifibatide.METHODS：the6-aminodecoquinate-N-hydroxylsuccinylimideformicether（AQC）wastakenasthederivativereagenttomakeforthecolumnquantitativederivatizationwitheachaminoacidandthentoelutebyReversephasechromatography.RESULTS：Goodlinearitieswereobtainedforallaminoacids.Themethodshowedhighselectivity，goodrepeatability，accuracyandstability.CONCLUSION：ThemethodissimpleandrapidanditisapplicablefordeterminationofAminoacidratioineptifibatide.KEYWORDSAccQ-Tag；ptifibatide；Aminoacidratio；氨基酸比值測(cè)定是多肽藥物質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，也是多肽原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分，通過測(cè)定多肽藥物的氨基酸理論個(gè)數(shù)比，從側(cè)面佐證多肽的結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)氨基酸比值的分析，可為多肽的結(jié)構(gòu)確證提供理論指導(dǎo)。建立準(zhǔn)確可靠的氨基酸比值分析方法是一項(xiàng)有意義的工作。國(guó)內(nèi)外研究和應(yīng)用于實(shí)際樣品中氨基酸比值分析的方法主要是色譜方法，包括離子交換法、反相高效液相色譜法、氣相色譜法［1］，按檢測(cè)方法可分為化學(xué)分析法、電化學(xué)方法、分光光度法等，按衍生反應(yīng)的先后，可分為柱前衍生［2］和柱后衍生法。氨基酸分析儀是柱后衍生反相高效液相色譜法的代表，已有很廣泛的應(yīng)用。在柱前衍生反相高效液相色譜法方面，不同的衍生劑對(duì)應(yīng)不同的方法，是目前研究的主體模式。筆者采用WATERS公司的AccQ-Tag試劑包［3］作為構(gòu)建方法的基本條件，通過優(yōu)化依替巴肽中氨基酸的前處理和色譜條件，以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯（AQC）為衍生試劑與各氨基酸柱前定量衍生后，再經(jīng)普通C18柱梯度洗脫，建立了依替巴肽中氨基酸比值的AccQ-Tag測(cè)試方法，應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析。結(jié)果表明，此方法具有專屬性，靈敏度高、重現(xiàn)性好。實(shí)驗(yàn)部分儀器及試藥L-門冬氨酸（批號(hào)：A0546）、甘氨酸（批號(hào)：G0099）、L-高精氨酸（批號(hào)：GJ01）、L-脯氨酸（批號(hào)：P0481）、L-胱氨酸（批號(hào)：C0519）對(duì)照品均購(gòu)于：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；依替巴肽原料藥（批號(hào)：20071019連云港宏創(chuàng)藥業(yè)有限公司）；AccQ-Tag試劑盒（Waters）；乙腈、磷酸為色譜純，三乙胺、鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙酸鈉，乙二胺四乙酸鈉均為分析純。Agilent1200系列（G1311A四元泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1314B紫外-可見光檢測(cè)器），Agilent化學(xué)工作站；梅特勒XS105電子分析天平；色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。實(shí)驗(yàn)方法AccQ-Tag衍生溶液的制備取衍生化試劑（2A）加人1ml乙腈，于55℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)使溶解，得衍生溶液。供試品溶液的制備取依替巴肽原料藥約10.5mg，于裂解瓶中，加入5mL6mol/L的鹽酸溶液，充氮密閉，于120℃條件下反應(yīng)24小時(shí)，取出放置至室溫，用氫氧化鈉溶液中和至中性，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用水定容，精密移取100趾置進(jìn)樣瓶中，加入700出硼砂緩沖溶液，再加入200出已配制好的衍生化試劑溶液，混勻后，放入已恒溫至55℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，反應(yīng)10分鐘后，作為供試品溶液。對(duì)照品溶液的制備精密稱取門冬氨酸（Asp）對(duì)照品16.6mg，甘氨酸（Gly）對(duì)照品9.4mg，高精氨酸（Harg）對(duì)照品28.0mg，脯氨酸（Pro）對(duì)照品14.4mg，胱氨酸（Cys）對(duì)照品15.0mg，置于50ml量瓶中，用水溶解并稀釋到刻度，混勻；精密移取2ml置裂解瓶中，加入6mol/L的鹽酸5ml，充氮密閉，于120℃條件下反應(yīng)24小時(shí)，取出放置至室溫，用NaOH中和至中性，轉(zhuǎn)移20ml量瓶中，用水定容，用水稀釋到刻度，混勻；精密移取100趾置進(jìn)樣瓶中，加入700趾硼砂緩沖溶液，再加入200比已配制好的衍生化試劑溶液，混勻后，放入已恒溫至55℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，反應(yīng)10分鐘后，取出放置至室溫，作為對(duì)照品溶液。1.2.4色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.05mol/L醋酸鈉緩沖液（取乙酸鈉11.5g，溶于900ml水中，加入1ml1mg/ml乙二胺四乙酸二鈉，再加入2.4ml三乙胺，磷酸調(diào)pH值至4.95,加水至1000ml）為流動(dòng)相A；乙腈-水（60:40）為流動(dòng)相B；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；進(jìn)樣體積10吐流速1.0mL/min；柱溫37℃。；采用梯度洗脫：2結(jié)果與討論系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以衍生化后的對(duì)照品溶液檢查系統(tǒng)適應(yīng)性，按“1.2.4”色譜條件，連續(xù)進(jìn)5針對(duì)照品溶液，門冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、高精氨酸（Harg）、脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）的衍生化產(chǎn)物依次出峰，色譜圖中相鄰的兩個(gè)峰最小分離度符合規(guī)定（RN1.5），分別計(jì)算各氨基酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果顯示RSD值均小于2.0%，表明該色譜系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。?。骸?.2.2”、“1.2.3”項(xiàng)下兩種溶液適量，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示。兩種溶液色譜圖見圖1、2。方法專屬性為了驗(yàn)證衍生試劑對(duì)氨基酸衍生物是否產(chǎn)生干擾，以水為樣品，按照“1.2.2”進(jìn)行衍生，得衍生空白溶液。按照“1.2.1”制備衍生樣品溶液，分別進(jìn)樣衍生空白溶液及衍生樣品溶液。結(jié)果表明，衍生試劑峰對(duì)各氨基酸衍生物峰均無(wú)干擾，各氨基酸獲得良好分離。檢測(cè)限與定量限配置各氨基酸濃度為100umol/L的貯備液，用純水稀釋分別測(cè)定各氨基酸的檢測(cè)限定量限。線性與范圍取氨基酸對(duì)照品配制成約為供試品濃度10%?500%相應(yīng)溶液測(cè)定氨基酸的線性與范圍，結(jié)果如下：門冬氨酸濃度在0.99nmol/ml?49.71nmol/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（n=7）；A=18.4477xC+1.9320,r=0.9992。甘氨酸濃度在0.99nmol/ml?102.86nmol/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（n=8）；A=25.1343xC+7.5896,r=0.9993精氨酸濃度在1.00nmol/ml?100.27nmol/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（n=8）；A=28.6629xC-11.6078,r=0.9999脯氨酸濃度在1.00nmol/ml?50.17nmol/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（n=7）；A=23.5634xC+4.2263，r=0.9998。穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品（批號(hào)：20071019）,按“1.2.2”工真下方法制備供試品溶液，并在室溫下放置，分別與2、4、6、8、12、24時(shí)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，門冬氨酸濃度平均值為90.32mol/L,SD=0.86%；甘氨酸濃度平均值為86.64mol/L,SD=0.37%；脯氨酸濃度平均值為87.04mol/L,SD=0.31%；半胱氨酸濃度平均值為108.60mol/L,SD=0.57%；,表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗(yàn)取同一樣品（批號(hào)：20071019）,按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定各氨基酸的含量，重復(fù)測(cè)定6次。門冬氨酸濃度平均值為90.32mol/L,SD=0.86%；甘氨酸濃度平均值為86.64mol/L,SD=0.37%；脯氨酸濃度平均值為87.04mol/L,SD=0.31%；半胱氨酸濃度平均值為108.60mol/L,SD=0.57%,表明方法重復(fù)性良好?；厥章试囼?yàn)取樣品（批號(hào)：20071019）,按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,作為回收率基質(zhì),分別配置80%、100%與120%的對(duì)照品溶液進(jìn)行加樣回收試驗(yàn),結(jié)果如下：門冬氨酸平均回收率為97.9%,RSD為1.71%,甘氨酸平均回收率為94.4%,RSD為1.36%,精氨酸平均回收率為99.7%,RSD為1.65%,脯氨酸平均回收率為100.4%,RSD為1.26%。樣品測(cè)定3結(jié)論本文建立了HPLC與柱后衍生相結(jié)合檢測(cè)依替巴肽中氨基酸比值的分析方法,對(duì)該分析方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法選擇性好,具有良好的線性、專屬性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性,能快速高效地測(cè)定依替巴肽中的氨基酸比值,可滿足生產(chǎn)企業(yè)及檢測(cè)機(jī)構(gòu)的實(shí)際要求,同時(shí)可為其他多肽類藥物中氨基酸的檢測(cè)分析提供參考。參考文獻(xiàn)：[1]李方樓，姬小明，魏躍偉等.AccQ-Tag-HPLC法測(cè)定煙葉生長(zhǎng)過程中游離氨基酸的變化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2011,39（27）：17010-17012[2]張怡,孫晉紅,葉汝漢.反相高效液相色譜測(cè)定依替巴肽注射液中氨基酸的含量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào).2013,32（8）：1003-1006[3]朱偉偉，藍(lán)建京.犀牛角氨基酸組成分析與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科區(qū) 1電 工10 Md?孝k臺(tái)萋*區(qū) 1電 工10 Md?孝k臺(tái)萋*Aw「= 星EH-?InHZ'r.r wJgw宅?號(hào)FF1 空￡=，毛3.工 凄方小---T-H-L「圖1對(duì)照品溶液UWD1+，注「?24Brun〔比依U32MU1AT骷訴的二個(gè)題定也購(gòu)122go0轉(zhuǎn)口1501口卜韓Ti￡『￥￡.?意一二一之宮逑二禹需 8;忠區(qū)正二-EfLE 史忠.|1