植物工廠化育苗的工廠與設(shè)備

關(guān)于植物工廠化育苗的工廠與設(shè)備2第一節(jié)實驗室一、實驗室植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。

實驗室設(shè)計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。第2頁,共89頁，2024年2月25日，星期天準備室培養(yǎng)室溫室Text實驗室接種室接種室實驗室組成：第3頁,共89頁，2024年2月25日，星期天4基本實驗室布局平面圖實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室第4頁,共89頁，2024年2月25日，星期天5準備實驗室第5頁,共89頁，2024年2月25日，星期天6緩沖室第6頁,共89頁，2024年2月25日，星期天7無菌室第7頁,共89頁，2024年2月25日，星期天8無菌室第8頁,共89頁，2024年2月25日，星期天99無菌室第9頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1010第10頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1111培養(yǎng)架第11頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1212培養(yǎng)室第12頁,共89頁，2024年2月25日，星期天13溫室第13頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1414第14頁,共89頁，2024年2月25日，星期天15第二節(jié)儀器與設(shè)備第15頁,共89頁，2024年2月25日，星期天冰箱酸度計電爐1.基本設(shè)備第16頁,共89頁，2024年2月25日，星期天17第17頁,共89頁，2024年2月25日，星期天18天平純水器第18頁,共89頁，2024年2月25日，星期天19攪拌器第19頁,共89頁，2024年2月25日，星期天20蒸汽壓力滅菌鍋2.滅菌設(shè)備第20頁,共89頁，2024年2月25日，星期天21第21頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2222過濾滅菌裝置第22頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2323紫外滅菌燈管第23頁,共89頁，2024年2月25日，星期天243、無菌操作設(shè)備

超凈工作臺第24頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2525超凈工作臺第25頁,共89頁，2024年2月25日，星期天26無菌接種箱第26頁,共89頁，2024年2月25日，星期天27恒溫振蕩培養(yǎng)箱

光照培養(yǎng)箱4、培養(yǎng)設(shè)備第27頁,共89頁，2024年2月25日，星期天28搖床第28頁,共89頁，2024年2月25日，星期天295、細胞學鑒定設(shè)備光學研究顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡第29頁,共89頁，2024年2月25日，星期天30倒置顯微鏡光學顯微鏡第30頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實驗用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶第31頁,共89頁，2024年2月25日，星期天322、金屬材質(zhì)用具鑷子解剖刀接種針接種盤第32頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3333第二節(jié)培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是決定植物組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵因素之一。

培養(yǎng)基的構(gòu)成要素通?？煞譃椋孩偎?；②無機鹽類；③有機營養(yǎng)成分；④植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)；⑤天熱物質(zhì)；

⑥pH；⑦凝固劑等。第33頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3434構(gòu)成培養(yǎng)基的絕大部分組分為水分。在研究上，常用蒸餾水來配制培養(yǎng)基，而最為理想的水應該是純水。（一）水分第34頁,共89頁，2024年2月25日，星期天35※大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上；

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種※微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kgFe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種按照國際植物生理協(xié)會的建議：所需濃度>0.5mmol/L的元素為大量元素所需濃度<0.5mmol/L的元素為微量元素（二）礦質(zhì)元素第35頁,共89頁，2024年2月25日，星期天361.大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4NaH2PO4等。

K對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。第36頁,共89頁，2024年2月25日，星期天Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。Ca是構(gòu)成細胞壁的成分，對細胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細胞信號轉(zhuǎn)導中起重要作用。第37頁,共89頁，2024年2月25日，星期天382、微量元素

在微量元素中，鐵的使用最大：

◆一些氧化酶的組成成分

◆葉綠素形成的必要條件

◆使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀第38頁,共89頁，2024年2月25日，星期天39

硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運輸有著密切的關(guān)系

銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生長

錳參與植物的光合、呼吸代謝

鉬參與氮素的代謝氯是光合作用水光解的活化劑

微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。第39頁,共89頁，2024年2月25日，星期天（三）有機營養(yǎng)成分

培養(yǎng)基中的有機營養(yǎng)成分包括糖類物質(zhì)、維生素類和氨基酸類。第40頁,共89頁，2024年2月25日，星期天411.碳源

碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機酸，以糖類物質(zhì)最重要。糖類物質(zhì)特點：

◆具有熱易變的性質(zhì)◆利于吸收和利用

◆使用濃度一般在2%—5%

◆提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓第41頁,共89頁，2024年2月25日，星期天422.維生素類◆以各種輔酶的形式存在

◆參與多種代謝活動

◆對生長，分化等有很好的促進作用

◆主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素

◆常用維生素有VB1和VB6

第42頁,共89頁，2024年2月25日，星期天43

◆蛋白質(zhì)的組成成分◆有機氮源◆可直接被細胞吸收利用◆培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸

3.氨基酸第43頁,共89頁，2024年2月25日，星期天444.肌醇

◆環(huán)己六醇

◆細胞壁的構(gòu)建材料

◆參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動

◆促進活性物質(zhì)發(fā)揮作用第44頁,共89頁，2024年2月25日，星期天（四）植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑不僅可以促進植物組織的脫分化和形成愈傷組織，還可以誘導不定芽、不定胚的形成。最常用的有生長素和細胞分裂素，有時也會用到赤霉素和脫落酸。

第45頁,共89頁，2024年2月25日，星期天461.生長素類◆促進細胞伸長和分裂

◆促進生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、頂端優(yōu)勢、單性結(jié)實

◆誘導愈傷組織形成

◆溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好

◆常用的生長素：

IAA(吲哆乙酸)NAA(萘乙酸)2,4-D(2,4，二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸)第46頁,共89頁，2024年2月25日，星期天472.細胞分裂素類◆促進細胞分裂和分化

◆誘導胚狀體和不定芽的形成

◆延緩組織的衰老并增強蛋白質(zhì)的合成

◆用于離體成花的調(diào)控

◆溶于0.5-1.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中

◆常用的細胞分裂素：

KT(激動素)BA(6-卞基腺嘌呤)2-ip(異戊烯氨基嘌呤)ZT（玉米素）第47頁,共89頁，2024年2月25日，星期天483.赤霉素類和脫落酸A、赤霉素類◆組織培養(yǎng)中不常使用◆加速細胞的伸長生長◆促進細胞的分裂◆主要是GA3B、脫落酸◆抑制細胞分裂和伸長◆促進脫落和衰老◆促進休眠和提高抗逆能力GA3脫落酸第48頁,共89頁，2024年2月25日，星期天49

◆促進某些愈傷組織和器官的生長◆化學成分不明、復雜◆天然營養(yǎng)混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物（五）天然復合物第49頁,共89頁，2024年2月25日，星期天

50（六）pH在滅菌前，培養(yǎng)基的pH一般被調(diào)節(jié)到5.0~6.0

之間，最常用的pH為5.7~5.8。pH過高時，培養(yǎng)基會變硬；pH過低時，則影響培養(yǎng)基的凝固。50第50頁,共89頁，2024年2月25日，星期天51（七）凝固劑◆瓊脂是使用最普遍的凝固劑◆用量一般在6-10g/L之間◆顏色以淺、透明度高好，潔凈為上品除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)冷膠等。第51頁,共89頁，2024年2月25日，星期天52（八）其他添加物1.活性炭◆吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì)

◆抑制外植體褐變

◆防止玻璃苗的產(chǎn)生

◆促進培養(yǎng)物生長和分化

◆促進生根2.抗生素

◆防止外植體內(nèi)生菌造成的污染活性炭第52頁,共89頁，2024年2月25日，星期天5353二、培養(yǎng)基的基本類型◆培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基◆培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基◆其作用不同：誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基

◆營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基的種類◆成分和濃度不同：含鹽量較高的培養(yǎng)基、硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基、中等無機鹽含量的培養(yǎng)基、低無機鹽含量的培養(yǎng)基第53頁,共89頁，2024年2月25日，星期天54541、MS培養(yǎng)基◆無機鹽濃度高◆高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽◆含有一定數(shù)量的銨鹽◆營養(yǎng)豐富◆不需要添加更多的有機附加物（二）幾種常見培養(yǎng)基的特點第54頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共89頁，2024年2月25日，星期天562、White培養(yǎng)基

◆1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計

◆

1963年作了改良，提高MgSO4的濃度和增加硼元素◆無機鹽濃度較低◆使用廣泛◆在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果大量元素含量微量元素含量鐵鹽含量有機物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)24H2O300MnSO44H2O7.0煙酸0.3瓊脂8000MgSO47H2O720ZnSO47H2O3.0鹽酸硫胺素0.1

NaH2PO44H2O16.5MoO30.0001鹽酸吡哆辛0.1KCl65CuSO45H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：White培養(yǎng)基第56頁,共89頁，2024年2月25日，星期天573、B5培養(yǎng)基◆1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設(shè)計◆含有較低的銨鹽◆較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素組成成分數(shù)量(mg/l）組成成分數(shù)量(mg/l)KNO3

2500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO43.0煙酸1.0MnSO4·4H2O10鹽酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激動素0.1Na2MoO4·2H2O0.252,4－D0.1－1.0CoCl2·6H2O0.025鹽酸硫銨10Na2-EDTA37.3

B5培養(yǎng)基的組成和配方第57頁,共89頁，2024年2月25日，星期天584、N6培養(yǎng)基

◆1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計

◆

KNO3和(NH4)2SO4含量高，不含鉬組成成分數(shù)量(mg/l)組成成分(mg/l)KNO3

2.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4

400pH5.8(NH4)2SO4

463煙酸0.5KI0.8鹽酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4鹽酸硫銨1.0ZnSO4·7H2O1.5N6培養(yǎng)基組成及配方第58頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三章培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件第59頁,共89頁，2024年2月25日，星期天60為了減少工作量，減小誤差，最方便的方法是預先配制好不同組分的培養(yǎng)基母液。一、培養(yǎng)基母液的配制第60頁,共89頁，2024年2月25日，星期天611.配制母液原則

相同類型的試劑混合；易形成沉淀的藥品分開；母液濃度要適宜；用量要認真計算和核對；藥品要準確稱量。第61頁,共89頁，2024年2月25日，星期天62

2.MS培養(yǎng)基母液的配制

MS培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配成五種母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe鹽（100倍）、Ca鹽（50倍）、有機物（100倍）。

第62頁,共89頁，2024年2月25日，星期天63第63頁,共89頁，2024年2月25日，星期天643.激素母液的配制

生長素類、赤霉素類及脫落酸等用95％乙醇溶解；細胞分裂素類用1NHCl或1NNaOH溶解。

通常激素母液濃度生長素類為0.1~0.5mg/ml,細胞分裂素母液濃度為0.2~1.0mg/ml.第64頁,共89頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基的配制水藥品糖瓊脂混合加熱溶解調(diào)整pH玻璃器皿水洗干燥分裝滅菌封口冷卻接種第65頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1、取出母液并按順序放好。將潔凈的各種玻璃器皿如量筒、容量瓶、移液管、移液槍和玻璃棒等放在指定位置；2、取一只容量瓶，放入配制培養(yǎng)基總量的1/3左右純水，將母液按順序加入，并不斷攪拌；3、加入植物生長調(diào)節(jié)劑后定容；培養(yǎng)基的配制的具體步驟：第66頁,共89頁，2024年2月25日，星期天4、將定容的培養(yǎng)基倒入容器中，加入蔗糖和瓊脂，并加熱使其完全溶解；5、調(diào)整pH；6、將培養(yǎng)基分裝倒培養(yǎng)器皿中，封好瓶口；7、滅菌，用高壓鍋滅菌（121℃，15～20min）或過濾除菌；8、滅菌后待高壓鍋溫度下降到50℃以下時，便可以取出、冷卻凝固后待用。第67頁,共89頁，2024年2月25日，星期天68第68頁,共89頁，2024年2月25日，星期天69第69頁,共89頁，2024年2月25日，星期天三、培養(yǎng)基的保存

配制好的培養(yǎng)基一般要在室溫、黑暗且清潔的地方放置3～5天再使用。

保存時間太久，培養(yǎng)基可能會污染、脫水、易分解的成分會發(fā)生分解，培養(yǎng)基成分會發(fā)生較大的變化。

每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標簽。第70頁,共89頁，2024年2月25日，星期天71四、培養(yǎng)條件溫度光照濕度氣體培養(yǎng)基的滲透壓pH值植物材料一般最適溫度在25±2℃之間環(huán)境條件光強：1000~6000lx一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對濕度應達100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在70%~80%氧氣是愈傷組織生長所必需的調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手植物組織培養(yǎng)時培養(yǎng)基的pH值大多在5.0－6.5光質(zhì)：影響細胞分裂和器官分化光周期：光照16h，黑暗8h第71頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)基本操作一、洗滌1、玻璃器皿洗滌新購置玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用已用過的玻璃器皿第72頁,共89頁，2024年2月25日，星期天732、塑料用品洗滌塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%—5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用第73頁,共89頁，2024年2月25日，星期天743、金屬用品洗滌熱洗衣粉水洗凈沖洗擦干第74頁,共89頁，2024年2月25日，星期天751.滅菌方法：（1）物理方法：物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、物理除菌、過濾、離心、沉淀等（2）化學方法：消毒劑、抗菌素滅菌

75二、消毒滅菌第75頁,共89頁，2024年2月25日，星期天762、滅菌（1）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法壓力在9.8×104—10.8×104Pa

溫度在121℃

滅菌20—30min（2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌干熱消毒滅菌第76頁,共89頁，2024年2月25日，星期天77飽和蒸汽壓力與其對應的溫度飽和蒸汽壓力溫度（℃）飽和蒸汽壓力溫度（℃）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0001.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6第77頁,共89頁，2024年2月25日，星期天78（3）塑料器皿滅菌：多采用高壓蒸汽消毒滅菌（4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用（5）過濾滅菌：一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素。第78頁,共89頁，2024年2月25日，星期天79（6）接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈工作臺紫外燈照射70%—75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種紫外燈照射第79頁,共89頁，2024年2月25日，星期天80（7）外植體滅菌流水沖洗10—20min或更長時間70%—75%酒精中浸泡30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗4—5次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用第80頁