生物化學(xué)實驗

關(guān)于生物化學(xué)實驗實驗一總糖的測定——蒽酮比色法第2頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗要求掌握蒽酮比色定糖法的原理和方法掌握72型分光光度計的原理和操作方法學(xué)習(xí)通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測定未知物含量的方法第3頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗原理糖類在較高溫度下經(jīng)濃無機酸作用脫水產(chǎn)生糠醛或糠醛衍生物，可與蒽酮縮合成藍(lán)綠色化合物，顏色深淺與糖量成正比。本法多用于測定糖原含量，也可用于測定葡萄糖含量。第4頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗內(nèi)容與結(jié)果1、制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線2、測定樣品含糖量計算100克小麥面粉中總糖含量第5頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗二氨基酸的分離鑒定——紙層析法第6頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗要求學(xué)習(xí)分配層析法的原理掌握氨基酸紙上層析的操作技術(shù)（包括點樣、平衡、展層、顯色及鑒定）第7頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗原理紙層析法是以濾紙作支持物，紙纖維上的羥基具有親水性，能吸附一層水作固定相，而與水不相混合的有機溶劑作流動相，因此利用分配層析原理，不同物質(zhì)在兩相間有不同的分配系數(shù)而在紙上移動的距離不同，即被分開。本實驗分離的是混合氨基酸樣品，層析之后用茚三酮試劑顯色。第8頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗內(nèi)容與結(jié)果1、點樣2、展層3、顯色用鉛筆描出顯色斑點的形狀，測其距離并計算各氨基酸的Rf值。第9頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗三蛋白質(zhì)的等電點測定及沉淀反應(yīng)第10頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗要求了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點的一種方法通過實驗加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識區(qū)分可逆沉淀反應(yīng)及不可逆沉淀反應(yīng)并了解其實用意義了解蛋白質(zhì)變性及沉淀的關(guān)系第11頁,共52頁，2024年2月25日，星期天一、蛋白質(zhì)的等電點測定原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其解離狀態(tài)和程度受溶液的酸堿度影響。在等電點（pI）時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)有變化，可利用性質(zhì)的變化測定蛋白質(zhì)pI。常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。本實驗借觀察在不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。操作：用醋酸和醋酸鈉配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。第12頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)原理：蛋白質(zhì)是一類高分子化合物，分子大小已達(dá)膠體顆粒范圍（1~100毫微米）,因此蛋白質(zhì)在水溶液中具有膠體的性質(zhì)。維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素有兩個：一是膠體顆粒所帶的電荷，一是與介質(zhì)水形成的水化膜。這種穩(wěn)定性是有條件的、相對的，在一定物理化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷、脫水，甚至變性而喪失穩(wěn)定因素，從溶液中析出，這種作用稱為蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類：1）可逆沉淀反應(yīng)：如鹽析作用，等電點沉淀蛋白質(zhì)等。提純蛋白質(zhì)時，常用此類反應(yīng)。2）不可逆沉淀反應(yīng)：如重金屬鹽、生物堿試劑、過酸、過堿、加熱、震蕩、超聲波、有機溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀而析出。第13頁,共52頁，2024年2月25日，星期天操作1．蛋白質(zhì)的鹽析作用2．重金屬沉淀蛋白質(zhì)3．有機酸沉淀蛋白質(zhì)4．有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)5．生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)第14頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗四血清γ—球蛋白的分離、純化及鑒定第15頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗要求初步學(xué)會分離、純化蛋白質(zhì)的常用方法并了解其原理。學(xué)習(xí)鹽析、層析基本原理及實驗技術(shù)。掌握電泳基本原理，熟悉操作方法，了解影響電泳的因素。第16頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗原理（一）血清γ—球蛋白的分離血清蛋白質(zhì)先用鹽析初步分離。半飽和硫酸銨可沉淀血清球蛋白而白蛋白不被沉淀，離心后白蛋白主要集中在上清液中，而球蛋白主要在沉淀中。將球蛋白沉淀溶于少量水中，裝于透析袋，透析除去硫酸銨。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液，在0.0175摩爾/升pH6.3磷酸緩沖液條件下加到DEAE—纖維素柱上，在此pH下，DEAE—纖維素帶正電荷，能吸附帶負(fù)電荷的白蛋白、α-及β-球蛋白，僅γ—球蛋白不能吸附而直接流出。第17頁,共52頁，2024年2月25日，星期天(二)血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠垂直板狀電泳利用聚丙烯酰胺凝膠作電泳支持物。聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，是由丙烯酰胺單體和少量交聯(lián)劑在催化劑、加速劑的作用下發(fā)生聚合反應(yīng)而制得的，利用電泳和分子篩的雙重作用分離物質(zhì)，分辨力較高。血清蛋白在紙上電泳可分為5~7個組分，而在聚丙烯酰胺電泳上可分出12~25個組分。第18頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗內(nèi)容（一）

血清γ—球蛋白的分離純化1．硫酸銨鹽析：注意應(yīng)緩慢滴入飽和硫酸銨溶液并邊加邊搖，避免局部濃度過高。2．透析脫鹽：用納氏試劑檢查水中NH4+，直至硫酸銨全部透析完畢。

3．DEAE—纖維素柱層析：裝柱、平衡柱床、上樣、洗脫收集。4．檢查洗脫液中蛋白質(zhì)：磺基水楊酸檢查，出現(xiàn)白色沉淀即有蛋白質(zhì)析出。合并蛋白質(zhì)含量高的洗脫液，以備鑒定。第19頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（二）

血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠垂直板狀電泳1．凝膠板的制備：板狀電泳槽按要求夾好、固定，用1%瓊脂封邊，并按比例配制凝膠，灌入凝膠板。2．樣品的準(zhǔn)備：樣品中加入樣品稀釋液，內(nèi)含溴酚蘭為示蹤染料。3．電泳：將上電泳槽的電極接電泳儀的負(fù)極，下電泳槽接正極，調(diào)節(jié)電壓為150伏，電泳約1小時。4．剝膠5．固定、染色、脫色第20頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗結(jié)果將分離純化的蛋白質(zhì)收集，經(jīng)電泳分離并與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作對照，繪出電泳圖譜。第21頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗五維生素C的定量測定——2，6-二氯酚靛酚法

第22頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗要求學(xué)習(xí)定量測定維生素C的原理和方法。掌握微量滴定法的基本操作技術(shù)。第23頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗原理維生素C又名抗壞血酸，是水溶性維生素，具有很強的還原性，在堿性和微酸性環(huán)境中，能還原2，6-二氯酚靛酚成無色的還原型2，6-二氯酚靛酚，同時自身被氧化成脫氫抗壞血酸。氧化型的2，6-二氯酚靛酚在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色，當(dāng)用2，6-二氯酚靛酚滴定含有抗壞血酸的酸性溶液時，在抗壞血酸尚未全部被氧化時，滴下的2，6-二氯酚靛酚立即呈現(xiàn)無色，當(dāng)溶液從無色轉(zhuǎn)變成微紅色時，即表示溶液中的抗壞血酸剛剛?cè)勘谎趸?，此時即為滴定終點，可以算出被檢物質(zhì)中抗壞血酸的含量。第24頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗內(nèi)容與結(jié)果1、提取維生素C2、用2，6-二氯酚靛酚鈉溶液滴定標(biāo)準(zhǔn)維生素C，計算1毫升2，6—二氯酚靛酚溶液相當(dāng)于抗壞血酸多少毫克。3、用2，6-二氯酚靛酚鈉溶液滴定樣品維生素C，計算100克樣品所含維生素C的毫克數(shù)。4、注意事項：滴定過程必須迅速。第25頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗六肝臟堿性磷酸酶的提取及活力測定

第26頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗要求學(xué)習(xí)和掌握有機溶劑沉淀法提取堿性磷酸酶的原理和實驗技術(shù)。掌握以磷酸苯二鈉為底物測定堿性磷酸酶活力的原理和方法。第27頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗原理堿性磷酸酶（Alkalineplosphatase,簡稱AKP或ALP）是磷酸酶中的一種，廣泛存在于生物體中，參與物質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)。本實驗采用有機溶劑分步沉淀法提取AKP，即利用樣品中各種不同的成分在不同的有機溶劑中溶解度不同，反復(fù)進(jìn)行沉淀、溶解而達(dá)到分離純化的目的。第28頁,共52頁，2024年2月25日，星期天酶分離純化后需測定活力。比活性是指單位重量的酶蛋白樣品中所含的酶活性單位，隨著酶蛋白逐步純化，其比活性將隨之升高，因此測定酶的比活性可鑒定酶的純化程度。AKP屬水解酶，在堿性條件下（pH9～10）能水解多種磷酸酯。以磷酸苯二鈉作為酶的底物，水解產(chǎn)生的酚與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化可產(chǎn)生紅色醌類衍生物，根據(jù)紅色深淺通過分光度法測定酶活性。AKP蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測定?？捡R斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)結(jié)合生成藍(lán)色復(fù)合物，在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與顏色深淺成正比。第29頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗內(nèi)容與結(jié)果（一）AKP的提取勻漿→抽提→丙酮、乙醇反復(fù)沉淀→AKP純酶液注意事項：所用有機試劑必須預(yù)先預(yù)冷。提取過程中所有有機試劑濃度應(yīng)計算準(zhǔn)確，加量準(zhǔn)確。各階段提取液需取出部分待測比活性。第30頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（二）AKP比活性測定

1、

樣品酶活性測定：酶活性單位計算：在37℃下保溫15分鐘產(chǎn)生1毫克酚，稱為該酶的1個活性單位（U）。計算每毫升酶液的酶活性單位（U/mL）2、樣品酶蛋白含量測定：計算每毫升酶液的蛋白含量（mg/ml）

3、比活性計算：比活性（U/mg）=每毫升酶液的酶活性單位/每毫升酶液的蛋白含量4、注意事項：注意各階段的稀釋倍數(shù)及取樣量。各管加樣量要準(zhǔn)確，注意反應(yīng)時間。第31頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗七堿性磷酸酶酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗

第32頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗要求了解酶促反應(yīng)動力學(xué)的研究內(nèi)容及意義

通過檢測不同溫度條件下AKP的活性，了解溫度對酶活性的影響學(xué)習(xí)測定酶最適pH的方法，了解pH對酶活性的影響了解底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響，學(xué)習(xí)測定米氏常數(shù)（Km）的原理和方法。第33頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗原理酶促反應(yīng)動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)，如底物濃度、酶濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等，進(jìn)行酶促反應(yīng)動力學(xué)研究具有重要的理論和實踐意義。酶的催化作用受溫度的影響。當(dāng)溫度達(dá)到某一定值時，酶促反應(yīng)達(dá)到最高峰，此溫度稱為酶的最適溫度。第34頁,共52頁，2024年2月25日，星期天酶的活力受環(huán)境pH的影響極為顯著。通常只有在一定的pH范圍內(nèi)，酶才表現(xiàn)其催化活性，且在某一pH時，酶的活性才達(dá)最大值，稱為最適pH值，不同酶的最適pH值不同。在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶的催化作用有很大的影響。一般情況下，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r，酶促反應(yīng)速度（V）隨底物濃度（[S]）的增加而迅速增加；但當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時，反應(yīng)速度的增加率就比較小；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾又聊撤N程度時，反應(yīng)速度達(dá)到一個極限值（Vm）。Km值是酶的一個特征常數(shù)，是反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度。Km可以近似表示酶與底物的親和力，測定Km是酶學(xué)研究的一個重要方法。第35頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗內(nèi)容1、溫度對酶活性的影響2、pH對酶活性的影響3、底物濃度對酶活性的影響（Km的測定）

第36頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗結(jié)果1、比較各種溫度對AKP酶活性的影響，確定其最適溫度。2、比較各種pH對AKP酶活性的影響，確定其最適pH值。3、以酶活性單位代表各管中酶反應(yīng)速度(v)作縱坐標(biāo)，以底物濃度（[s]）為橫坐標(biāo)，連接各點，觀察該圖形的形狀。以酶活性單位的倒數(shù)（1/v）為縱坐標(biāo)，底物濃度的倒數(shù)（1/[s]）為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙描出各點并連接，求該酶的Km值。第37頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗八

胰島素和腎上腺素對血糖濃度的影響第38頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗要求了解胰島素及腎上腺素調(diào)節(jié)機體血糖濃度的機理與效果學(xué)會制備無蛋白血濾液掌握磷鉬酸比色法測定血糖的原理和方法第39頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗原理人和動物體內(nèi)，血糖濃度受各種激素調(diào)節(jié)而維持恒定。胰島素促進(jìn)肝臟和肌肉將葡萄糖合成糖原，又加強糖的氧化作用，故可以降低血糖；腎上腺素促進(jìn)肝糖原分解而增高血糖。葡萄糖的醛基具有還原性，與堿性銅試劑混合加熱后，被氧化成羧基，而堿性銅試劑中的二價銅則被還原成磚紅色的氧化亞銅沉淀，氧化亞銅又可使磷鉬酸還原生成鉬藍(lán)，使溶液呈藍(lán)色，其藍(lán)色深淺與葡萄糖的濃度成正比。第40頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗內(nèi)容與結(jié)果1、激素的作用：動物準(zhǔn)備→取空腹血→注射激素后取血

2、血糖的測定：無蛋白血濾液的制備測定血糖計算：樣品的血糖含量(毫克%)注意事項：血糖測定反應(yīng)在取血后2小時內(nèi)完成，放置過久，糖易分解，使含量減低。磷鉬酸試劑宜貯于棕色瓶中，如出現(xiàn)藍(lán)色，表明試劑本身已被還原，不能用。堿性銅試劑中有氧化亞銅沉淀，也不能用。第41頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗九

肝細(xì)胞DNA的制備及含量測定第42頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗要求學(xué)習(xí)和掌握濃鹽法從肝細(xì)胞中提取DNA的原理操作技術(shù)學(xué)習(xí)紫外分光光度計測定DNA含量的原理和操作方法熟悉紫外分光光度計的基本原理和使用方法學(xué)習(xí)定糖法（二苯胺法）測定DNA含量的原理和操作技術(shù)第43頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗原理DNA的制備：DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的。動物和植物組織的脫氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或濃鹽溶液（如1摩爾/升氯化鈉），但在0.14M鹽溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）則溶于稀鹽溶液,利用這一性質(zhì)可將DNP與RNP以及其他雜質(zhì)分開。分離得到DNP之后，必須將其中蛋白質(zhì)除去。用十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，使DNA與蛋白質(zhì)分開，然后用氯仿-異戊醇乳化蛋白質(zhì)，離心除去變性蛋白質(zhì)，再用乙醇抽提DNA。第44頁,共52頁，2024年2月25日，星期天DNA含量測定：DNA具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在260毫微米波長處。核酸的消光系數(shù)（或吸收系數(shù)）用ε(p)表示，即每升含有一克原子核酸磷的光吸收值（即A值），因此，用紫外分光法測定核酸含量時規(guī)定：在260毫微米波長下，每毫升含1微克DNA溶液的消光值（即O.D.260）為0.020,而每毫升含1微克RNA溶液的O.D.260值為0.022,故測定未知濃度DNA溶液的O.D.260，即可計算出DNA的含量。DNA被酸水解后生成的脫氧核糖可以與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595毫微米處有最大吸收。DNA在40~400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA濃度成正比。第45頁,共52頁，2024年2月25日，星期天實驗內(nèi)容與結(jié)果1、DNA的制備：肝臟勻漿→離心→正丁醇脫脂→SDS使DNP中DNA游離→氯仿-異戊醇使蛋白質(zhì)變性和溶解脂類→離心→乙醇沉淀DNA→無水乙醇反復(fù)DNA注意事項：勻漿程度和次數(shù)需嚴(yán)格限制。勻漿目的是破壞細(xì)胞膜，避免破壞細(xì)胞核。必須加入足夠量的SDS。攪拌應(yīng)小心，緩慢，避免將DNA絲狀物打斷。第