儀器分析：第八章 分子發(fā)光分析法 分子發(fā)光分析

2024/4/16第八章

分子發(fā)光分析法8.3.1

基本原理

8.3.2

化學發(fā)光反應的類型8.3.3化學發(fā)光分析裝置與技術(shù)8.3.4

化學發(fā)光分析法的應用第三節(jié)

化學發(fā)光分析法Molecular

luminescenceanalysisChemiluminescenceanalysis2024/4/168.3.1基本原理1.化學發(fā)光反應

在化學反應過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光。

A+B=C+D*；D*→D+hν(1)能夠發(fā)光的化合物多為有機化合物(芳香族)(2)多為氧化還原反應，激發(fā)能與反應能相當

E=170～300kJ/mol，位于可見光區(qū)。(3)發(fā)光持續(xù)時間較長，反應持續(xù)進行

化學發(fā)光反應存在于生物體中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)。2024/4/162.化學發(fā)光效率化學效率：發(fā)光效率：時刻t的化學發(fā)光強度(單位時間發(fā)射的光量子數(shù))dc/dt

分析物參加反應的速率。2024/4/163.化學發(fā)光強度與化學發(fā)光分析的依據(jù)在化學發(fā)光分析中，被分析物相對于發(fā)光試劑小得多，對于一級動力學反應：

dc/dt

=kc；

k：反應速率常數(shù)。定量依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強度與被測物濃度成線性；（2）曲線下面積為發(fā)光總強度(S)，其與被測物濃度成線性：2024/4/164.抑制化學發(fā)光分析

抑制化學發(fā)光分析是利用某物質(zhì)對化學發(fā)光反應的抑制作用進行定量分析的方法。如在魯米諾-KMnO4發(fā)光體系中，Cu2+對該發(fā)光反應產(chǎn)生抑制作用，使發(fā)光強度顯著降低，發(fā)光強度的降低量與Cu2+的濃度有關(guān)。該方法已用于水中微量銅的定量測定。2024/4/168.3.2化學發(fā)光反應的類型1.氣相化學發(fā)光反應(1)一氧化氮與O3的發(fā)光反應

NO+O3

→NO2*；NO2*→NO2+hν

發(fā)射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng·mL-1。(2)氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應

O3

→O2+O（1000C石英管中進行）

SO2

+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2+hν

最大發(fā)射波長：200nm；靈敏度1ng·mL-1。

2024/4/16

O3

→O2+O（1000C石英管中進行）

NO+O→NO2*；NO2*→NO2+hν

發(fā)射光譜范圍：400～1400nm；靈敏度1ng·mL-1。氧原子與CO的發(fā)光反應：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h

發(fā)射光譜范圍：300～500nm，靈敏度1ng·mL-1。氧原子與NO的發(fā)光反應：2024/4/16(3)乙烯與O3的發(fā)光反應

乙烯與O3反應，生成激發(fā)態(tài)乙醛：

CH2O*→CH2O+h

最大發(fā)射波長：435nm；對O3的特效反應；線性響應范圍1ng·mL-1

～1g·mL-1。2024/4/162.火焰中的化學發(fā)光反應

在富氫火焰中，也存在著很強的化學發(fā)光反應；（1）一氧化氮

NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h

發(fā)射光譜范圍：660～770nm。

最大發(fā)射波長：690nm。

在富氫火焰中：

NO2+2H→NO+H2O

該反應十分迅速。2024/4/16（2）硫化物

揮發(fā)性硫化物SO2

，H2S

，CH3SH，CH3SCH3

等在富氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強的化學發(fā)光（藍色）：

SO2

+2H2→S+2H2OS+S→2S2

*

S2*→S2+hν發(fā)射光譜范圍：350～460nm。最大發(fā)射波長：394nm；靈敏度：0.2ng·mL-1。

發(fā)射光強度與硫化物濃度的平方成正比。2024/4/163.液相中的化學發(fā)光反應

機理研究較多，應用最多；可測痕量的H2O2

，Cu，Mn，Co，V，F(xiàn)e，Cr，Ce，Hg，Th等。魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）在堿性溶液中與雙氧水的反應過程：化學發(fā)光反應效率：0.15～0.05；反應速率慢，某些金屬離子可催化反應；利用這一現(xiàn)象可測定這些金屬離子。2024/4/16化學發(fā)光試劑2024/4/16

草酸二酯(能量提供體)+高濃度雙氧水+稠環(huán)芳烴(能量接受體)+金屬離子+溶劑組成的反應體系，可發(fā)出很強的可見光，發(fā)光效率高，使用不同的稠環(huán)芳烴，發(fā)射出不同顏色的光(冷光源)。2024/4/164.生物發(fā)光反應

生物發(fā)光是涉及生物或酶反應的一類化學發(fā)光(生物體內(nèi)的發(fā)光)，有很高的發(fā)光效率(>50%)。著名的螢火蟲發(fā)光反應的過程為式中，LH2

為熒光素，E是熒光素酶，PPi是焦磷酸鹽，ATP是三磷酸腺苷，AMP是單磷酸腺苷。

利用上述反應可測定ATP。最大發(fā)射波長562nm。對10

g試樣，檢出限可低達10-14

g。

AMP·LH2

·E+O2

[氧化熒光素]*+AMP+CO2

+

H2O[氧化熒光素]*氧化熒光素+h

2024/4/16生物發(fā)光分析

許多生化反應通常都涉及H2O2的生成或有H2O2參與反應，可利用魯米諾發(fā)光體系來測定許多生化試劑或組分。例：2024/4/162024/4/168.3.3化學發(fā)光分析發(fā)的裝置與技術(shù)

裝置流程：發(fā)光反應室光檢測器信號放大器顯示與記錄

發(fā)光反應可采用靜態(tài)或流動注射的方式進行：

靜態(tài)方式：用注射器分別將試劑加入到反應器中混合，測最大光強度或總發(fā)光量；試樣量小，重復性差。

流動注射方式：用蠕動泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時通過測量室，連續(xù)發(fā)光，測定光強度；試樣量大。2024/4/168.3.4化學發(fā)光分析的應用1.發(fā)光反應速率慢，某些金屬離子可催化反應；

利用這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子?？蓽y痕量的Cu2+

，Mn2+，Co2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Ni2+，Ag+，Hg2+等。2.可檢測低至10-9mol·L-1

的H2O2。3.間接測定某些生物試樣：

氨基酸+O2

酮酸+NH3

+H2O2

葡萄糖+O2

+H2O

葡萄糖酸+H2O2通過測定生成的H2O2，確定氨基酸、葡萄糖含量。2024/4/16生物發(fā)光分析應用1在pH7～8；熒光素酶(E)和Mg2+的存在下，熒光素(LH2)與三磷酸腺苷(ATP)的反應，生成磷酸腺苷(AMP)熒光素和熒光素酸的復合物和鎂的焦磷酸鹽(PPi)：ATP+LH2

+E+Mg2+

AMP·LH2·E+Mgppi

+2H+pH7-8復合物與氧反應，產(chǎn)生化學發(fā)光：

AMP·LH2·E+O2[氧化熒光素]*+AMP+CO2+

H2O[氧化熒光素]*氧化熒光素+hν最大發(fā)射波長562nm。2024/4/16生物發(fā)光分析應用2

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在細菌中的黃素酶作用下，在氧化型黃素單核苷酸(FMA)存在下，發(fā)生發(fā)光反應：NADH

+FMA

+H+

NAD+

+FMNH2NADH脫氫酶FMNH2+RCHO

+O2

FMN+RCOOH+H2O+hν黃素酶最大發(fā)射波長495nm。2024/4/16化學發(fā)光分析法的特點1.靈敏度極高例：熒光素酶和三磷酸腺苷(ATP)的化學發(fā)光分析，可測定210-17mol·L-1ATP，可檢出一個細菌中的ATP含量。2.儀器設備簡單