細(xì)胞破碎技術(shù)

關(guān)于細(xì)胞破碎技術(shù)前言細(xì)胞破碎是了解細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu),獲得細(xì)胞內(nèi)含物的必要手段。胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性差,條件不適極易失活。特別是微生物細(xì)胞十分微小,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較緊密,一般方法不易將細(xì)胞打破,有些技術(shù)雖然可以,但條件嚴(yán)苛,胞內(nèi)生物活性物質(zhì)在此條件下很易失活,限制了一些技術(shù)的應(yīng)用。在一定程度上細(xì)胞破碎仍是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)。

第2頁,共127頁，2024年2月25日，星期天破碎細(xì)胞的方法和技術(shù)

細(xì)胞破碎方法┌───────┴───────┐物理法化學(xué)法

滲透超聲高壓球磨研磨堿處酶法有機表面休克波法釋放法法理法溶劑活性法法法劑法第3頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)

微生物細(xì)胞外膜使細(xì)胞具有剛性的外形,由胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁組成,其結(jié)構(gòu)影響著細(xì)胞破碎。胞質(zhì)膜保持著細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)濃度梯度,主要由蛋白質(zhì)和脂類組成。沒有細(xì)胞壁時,膜對滲透休克敏感,對其它破碎方法影響較小。細(xì)胞壁是破碎的主要障礙,其組成和結(jié)構(gòu)對細(xì)胞破碎有重要影響。細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)與遺傳和環(huán)境因素有關(guān),但在微生物的種屬中也存在總結(jié)構(gòu)上的相似性。

第4頁,共127頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)菌細(xì)胞壁的組成

1964年Salton首次利用機械破碎法破碎細(xì)菌細(xì)胞，對細(xì)菌細(xì)胞壁組成、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。對格蘭氏陽性菌和格蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有了較為全面認(rèn)識。除了菌質(zhì)和一些L-型和嗜鹽菌以外，幾乎所有的細(xì)菌的壁的較堅硬部分都是由短肽交聯(lián)的糖原鏈，即粘肽構(gòu)成，圍繞著細(xì)胞形成連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞具有一定的形狀和強度。第5頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌細(xì)胞壁的組成

細(xì)菌粘肽結(jié)構(gòu)示意圖

N-乙酰基胞壁酸(M)和N-乙?；咸烟前?G)交替形成糖原束,由M引出的縱點代表四肽單元的氨基酸殘基，橫點代表肽交聯(lián)橋第6頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌細(xì)胞壁的組成

不同物種的N-乙?；谒嵩谄鋫?cè)鏈基團上的取代有變化。但對糖原鏈的三維結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。N-乙酰基胞壁酸殘基的乳酸基與肽鏈結(jié)合，將糖原鏈聯(lián)結(jié)起來形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。至少N-乙?；谒釟埢娜轷；糠挚蔀樗碾膯卧〈?，相鄰的糖原鏈由肽橋交聯(lián)。大腸桿菌大約有50%的四肽單元未交聯(lián)，其它的僅作為二聚體交聯(lián)。在嗜酸乳酸菌中，大約有90%的四肽單元交聯(lián)，約30%的四肽單元作為三聚體交聯(lián)。第7頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌細(xì)胞壁的組成

雖然幾乎所有的細(xì)菌都含有基本的粘肽網(wǎng)結(jié)構(gòu)，但格蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的壁結(jié)構(gòu)有明顯不同。格蘭氏陽性菌的壁相當(dāng)厚，約15-50nm，含有40-90%的由基礎(chǔ)多糖和磷壁酸質(zhì)組成的粘肽，一些種屬的細(xì)胞表面有規(guī)律地排列著蛋白質(zhì)亞基。格蘭氏陰性菌細(xì)胞壁由薄的粘肽層(1.5-2.0nm)和在電子顯微照片上看如同胞質(zhì)膜一樣的外膜組成，粘肽層上還共價結(jié)合有脂蛋白，一些種屬在外膜上另外還有一層規(guī)律排列的蛋白質(zhì)亞基。第8頁,共127頁，2024年2月25日，星期天酵母細(xì)胞壁

酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)更難加以說明?？偟慕Y(jié)構(gòu)要比格蘭氏陽性菌的厚些。面包酵母細(xì)胞壁大約為70nm，且隨培養(yǎng)時間的增加細(xì)胞壁加厚。

酵母細(xì)胞壁含有大量葡聚糖，甘露聚糖和蛋白質(zhì)，但不清楚以怎樣的方式結(jié)合形成基本結(jié)構(gòu)。在葡聚糖鏈上有β(1,3)和β(1,6)鍵聯(lián)結(jié)的分支鏈結(jié)構(gòu)。酵母細(xì)胞壁的甘露聚糖主要是由α(1,2)糖苷鍵和少量的α(1,3)糖苷鍵聯(lián)結(jié)的甘露糖組成，另外，也有通過α(1,6)糖苷鍵聯(lián)結(jié)的甘露寡糖側(cè)鏈，在甘露糖殘基上有時也有磷酸二酯鍵。在酵母細(xì)胞壁上發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)主要是與甘露糖復(fù)合，多數(shù)是酶，而不是結(jié)構(gòu)組分。

第9頁,共127頁，2024年2月25日，星期天酵母細(xì)胞壁

格蘭氏陽性(a)和陰性(b)細(xì)菌的細(xì)胞壁的橫斷面圖

CM代表胞質(zhì)膜;CW為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu);SU為有規(guī)律排列的亞基;PG為粘肽層;OM為格蘭氏陰性菌的外膜；類型不同，亞基可能存在也可能不存在。

第10頁,共127頁，2024年2月25日，星期天酵母細(xì)胞壁酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)示意圖

外層甘露聚糖(M)通過磷酸二酯鍵與蛋白(P)結(jié)合，內(nèi)部蛋白含有交聯(lián)的糖原(G)第11頁,共127頁，2024年2月25日，星期天真菌細(xì)胞壁

大多數(shù)真菌的細(xì)胞壁是由多糖和少量的蛋白質(zhì)及脂類組成，但組成變化很大，只有個別的真菌細(xì)胞壁作了較詳細(xì)研究。正如細(xì)菌和酵母一樣，多糖是構(gòu)成細(xì)胞形狀和耐受破碎的主要結(jié)構(gòu)物。真菌細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)的多樣性，不能將一個種屬的結(jié)果推廣到另一個種屬上。從影響細(xì)胞破碎的角度看，有其共同點，就是菌絲體生長過程中細(xì)胞壁的變化對細(xì)胞破碎的影響。

第12頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞壁組分與真菌分類

關(guān)鍵多糖分類組纖維素，糖原集胞(粘)菌綱(Acrasiomycetes)

纖維素，β-葡聚糖卵菌目(Oomycetes),水霉目(Saprolegnicales)

霜霉目(Peronosporales),水節(jié)霉目(Leptomitales)

纖維素，殼多糖，卵菌目(Oomycetes),水節(jié)霉目(Leptomitales)β-葡聚糖纖維素，殼多糖絲壺菌目(Hyphochytridiomycetes)

去乙酰基殼多糖，接合菌目(Zygomycetes)

殼多糖殼多糖，β-葡聚糖壺菌目(Chytridiomycetes),

子囊菌目[(Ascomycetes),除了半子囊菌亞綱

(Hemiascomycetidae)],擔(dān)子菌綱[Basidiomycetes)除了擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)]

甘露糖,β-葡聚糖半子囊菌綱(Hemiascomycetidae)

甘露糖,殼多糖紅酵母科(Rhodotorulaceae)第13頁,共127頁，2024年2月25日，星期天真菌細(xì)胞壁粗糙脈孢菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)示意圖

層次組成：(a)最外層由α-和β-葡聚糖混合組成,(b)葡聚糖組合在蛋白類材料中的糖蛋白網(wǎng)絡(luò),(c)主要是蛋白質(zhì)類物質(zhì),(d)內(nèi)部的殼多糖類物質(zhì)區(qū)，嵌鑲在蛋白類物質(zhì)中的微原纖維殼多糖。

第14頁,共127頁，2024年2月25日，星期天真菌細(xì)胞壁

裂褶菌(Schizophyllumcommune)細(xì)胞壁的組分雖然與之不同，但具有相同的層次結(jié)構(gòu)。三種聚合物(R)-葡聚糖，(S)-葡聚糖和殼多糖大約占細(xì)胞壁干重的70%，(R)-葡聚糖是一個高分枝聚合物，分支點為β(1,3)和β(1,6)，且與壁的惰性層中的微原纖維殼多糖復(fù)合。真菌細(xì)胞壁的強度與聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，至少含有的纖維狀的殼多糖和纖維素對細(xì)胞強度有增強作用。第15頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與破碎

微生物細(xì)胞壁的形狀和強度與壁內(nèi)結(jié)構(gòu)聚合物的結(jié)構(gòu)和它們彼此之間交聯(lián)及與其它組分的交聯(lián)程度有關(guān)。為達(dá)到破碎細(xì)胞目的，必須打破這種共價結(jié)合的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)不僅與其遺傳特性有關(guān)，也與其生長環(huán)境和生長階段有關(guān)，而真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)還和發(fā)酵時的機械作用有關(guān)，因此表現(xiàn)為極其豐富的多樣性。利用機械破碎細(xì)胞時，細(xì)胞的形狀和大小，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)聚合物的交聯(lián)程度均是決定破碎難易的重要因素。要預(yù)知各種微生物細(xì)胞對機械破碎的耐受能力也有困難。第16頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與破碎

利用化學(xué)法和酶法破碎細(xì)胞時，了解細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)對選擇具體方法顯得十分重要。由于在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之上覆蓋有保護層，掌握它們的結(jié)構(gòu)組成和非結(jié)構(gòu)組成是選擇酶和化學(xué)方法的依據(jù)。然而，有關(guān)這些方面的知識還十分有限，還需使用其它方法對這種精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行更有效的研究。

第17頁,共127頁，2024年2月25日，星期天破碎分析

破碎細(xì)胞的目的主要有二，一是獲得細(xì)胞的內(nèi)含物，二是獲得細(xì)胞膜物質(zhì)。不論是那一種目的，獲得最大的破碎率是所有破碎技術(shù)追求的目標(biāo)。為了檢測破碎過程和破碎結(jié)果，需要快速、簡捷的細(xì)胞破碎程度的分析技術(shù)。細(xì)胞破碎率可直接利用完整細(xì)胞計數(shù)法或質(zhì)量檢測法，也可利用細(xì)胞釋放出來的特定組分間接測定。直接測定法是標(biāo)準(zhǔn)化法，間接測定法可能更有用，更有價值。可根據(jù)具體情況采用不同的測定方法。第18頁,共127頁，2024年2月25日，星期天1.直接測定法使用顯微鏡或用電子粒子計數(shù)器直接進(jìn)行完整細(xì)胞計數(shù),適合細(xì)胞破碎過程。然而，破碎釋放的物質(zhì)，如DNA和其它聚合物組分會干擾計數(shù)。為進(jìn)行顯微鏡計數(shù)，可進(jìn)行染色，以便區(qū)分破碎和未破碎細(xì)胞。例如破碎的格蘭氏陽性細(xì)菌會象陰性菌一樣染色；如格蘭氏染色法時，未破碎酵母細(xì)胞顯紫色，而破碎細(xì)胞顯亮紅色。對于量大的樣品，顯微鏡計數(shù)法耗時，枯燥；電子粒子計數(shù)器雖可測定酵母細(xì)胞破碎率，但大的細(xì)胞破碎物可能有干擾；用于細(xì)菌破碎率的測定時,靈敏度較低。

第19頁,共127頁，2024年2月25日，星期天2.間接測定法

依據(jù)破碎過程中破碎的細(xì)胞釋放的胞內(nèi)物質(zhì)量測算，如測定可溶性蛋白量或酶活性等，但需與破碎率達(dá)到100%的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。在使用酶活性測定法時需注意，由于粗酶提取物的酶動力學(xué)與完整細(xì)胞或純化的酶可能有差別而產(chǎn)生誤差。當(dāng)使用較濃的細(xì)胞懸浮液時，為獲得準(zhǔn)確結(jié)果，必須進(jìn)行校正。這是由于破碎細(xì)胞釋放胞內(nèi)物質(zhì)與水混合時會使體積增加。另外，稀釋法并不適合在破碎過程中易失活的物質(zhì)測定。因此需使用新的方法。

第20頁,共127頁，2024年2月25日，星期天(1)稀釋法

如果細(xì)胞破碎過程中失活不成為問題，可通過測定破碎樣品(Cu)和稀釋樣品(Cd)的上清液中的可溶性蛋白來測定破碎率。使用公式可獲得破碎樣品的水相體積百分?jǐn)?shù)(Fd),

Fd=(Vd/Vs)[Cd/(Cu-Cd)]

Vd為加到體積為Vs的破碎樣品中的稀釋劑體積。使用Folin-Lowry法或雙縮脲法測定蛋白質(zhì)，通過下式可得破碎懸浮物中單位質(zhì)量的細(xì)胞所含的蛋白質(zhì)(Rp)，

Rp=Fd(Cu/X)(2)

X是以干物重為基礎(chǔ)的細(xì)胞濃度。為計算細(xì)胞破碎率，必須測定相當(dāng)于破碎率為100%的Rp值。

第21頁,共127頁，2024年2月25日，星期天(1)稀釋法

一般來說，水相體積百分?jǐn)?shù)Fd與樣品的稀釋量無關(guān)。這也說明蛋白質(zhì)的溶解度不受樣品的稀釋的影響。但實際上，在多數(shù)條件下，稀釋會影響蛋白質(zhì)的溶解度，因此在采用稀釋法之前，要檢查稀釋對蛋白質(zhì)溶解度的影響。

第22頁,共127頁，2024年2月25日，星期天(2)質(zhì)量平衡法

破碎樣品的水相體積分?jǐn)?shù)(F)與樣品破碎前的水相體積分(Fo)及完整細(xì)胞內(nèi)的含水量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)M)的關(guān)系為：

F=Fo+(1-Fo)MR(Qc/Qaq)R為細(xì)胞破碎率，Qc為細(xì)胞密度，而Qaq為水懸浮介質(zhì)的密度。在上式中假設(shè)細(xì)胞內(nèi)水釋放會使水相體積分?jǐn)?shù)增加。利用凱氏定氮法測定破碎樣品水相(Cn)和未破碎細(xì)胞(Cno)的氮含量表示蛋白含量，它們與F和R的關(guān)系為：

R=FCn/CnoX第23頁,共127頁，2024年2月25日，星期天(2)質(zhì)量平衡法

將兩式合拚，刪去F項，得

R=FoCn/[CnoX-(1-Fo)CnM(Qc/Qaq)]

當(dāng)細(xì)胞濃度(X)高時，用直接測定法測定細(xì)胞濃有困難，也可從樣品的物理性質(zhì)和固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算得到。

X=QcQaqW(1-M)/[W(Qaq-Qc)+Qc(1-M)]

使用質(zhì)量平衡法計算細(xì)胞破碎率時使用了幾個假設(shè)，因此該方法的準(zhǔn)確度有時比稀釋法差。但是，當(dāng)稀釋影響蛋白的溶解度，不能使用稀釋法時，可以使用質(zhì)量平衡法測定細(xì)胞破碎率。

第24頁,共127頁，2024年2月25日，星期天(3)電導(dǎo)測定法

電導(dǎo)測定法是依據(jù)細(xì)胞物質(zhì)釋放到水中會改變?nèi)芤弘妼?dǎo)的原理發(fā)展的一種快速測定方法。細(xì)胞懸浮液電導(dǎo)的增加與細(xì)胞破碎率成正比。這種方法需要有其它方法作對比。因為電導(dǎo)與生物類型，保存條件，細(xì)胞濃度，溫度，懸浮介質(zhì)中的電解質(zhì)類型和含量等有關(guān)。因此，在利用電導(dǎo)測定法測定細(xì)胞破碎率時，為了保證測定的準(zhǔn)確，除破碎率以外,必須在保持的其它所有條件恒定的情況下進(jìn)行。

第25頁,共127頁，2024年2月25日，星期天滲透休克法第26頁,共127頁，2024年2月25日，星期天原理

依靠細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差突然加大造成細(xì)胞壁破裂,使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到溶液中。

將收集到的細(xì)胞用適當(dāng)?shù)木彌_液或生理鹽水洗滌，除去細(xì)胞沾染的培養(yǎng)基或其它雜質(zhì)，將其懸浮在含10-30%蔗糖的適當(dāng)緩沖液中，為了防止目的酶或蛋白質(zhì)失活，若目的酶或蛋白質(zhì)需要金屬離子時，在緩沖液中加入金屬離子；若金屬離子會使目的酶或蛋白質(zhì)失活，在緩沖液中需加入金屬離子螯合劑，如EDTA等。在低溫下，使細(xì)胞懸浮液混合均勻，放置使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓達(dá)到平衡。在低溫下離心，收集細(xì)胞；在激烈的攪拌下將細(xì)胞快速加到較大體積的低濃度的緩沖液中，由于細(xì)胞外滲透壓突然降低，使細(xì)胞破碎。第27頁,共127頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用

用此法處理大腸桿菌，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶I以及脫氧核糖核酸酶等釋放到溶液中。釋放的蛋白質(zhì)的量一般僅占細(xì)胞蛋白質(zhì)的4-7%。因此，后序的蛋白質(zhì)分離純化比較簡單。此法對細(xì)胞壁外有著牢固的糖蛋白包裹層，使胞內(nèi)滲透壓不受嚴(yán)重影響的格蘭氏陽性菌不適用。在高滲透壓環(huán)境下生長的細(xì)菌,如海洋細(xì)菌，嗜鹽細(xì)菌，更適合該法。如可有效的將海洋發(fā)光細(xì)菌的細(xì)菌熒光素酶釋放，酶釋放率可達(dá)到80-90%。

第28頁,共127頁，2024年2月25日，星期天超聲破碎法第29頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備和原理

超聲破碎器由高頻電發(fā)生器和產(chǎn)生高強度超聲信號的電功率轉(zhuǎn)換器構(gòu)成，并把超聲波傳送到與其接觸的溶液中。一般在頻率15-25KHz下進(jìn)行操作，由聲波的沖擊和振蕩，在溶液中產(chǎn)生空化作用，空化泡的急劇膨脹壓縮和內(nèi)向爆破產(chǎn)生沖擊彈性波，將聲能轉(zhuǎn)化為機械能，形成粘性消散渦流，如果液體旋渦小于細(xì)胞尺寸，產(chǎn)生不同密度移動，當(dāng)細(xì)胞的動能超過細(xì)胞壁強度時，至使細(xì)胞破碎。因此，細(xì)胞破碎率與輸入功率大小，細(xì)胞大小，細(xì)胞壁強度，細(xì)胞形狀和破碎時間有關(guān)。一般來說，超聲破碎對球狀或近球狀細(xì)胞較有效，對絲狀菌破碎效果較差。在輸入功率為60-195W的條件下，細(xì)胞破碎時的蛋白釋放與細(xì)胞濃度無關(guān)，最大細(xì)胞濃度可達(dá)60mg/ml。第30頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備和原理

在破碎輸入功率恒定條件下，對面包酵母破碎實驗過程的理論分析得出以下關(guān)系式:1-Rp=exp-(kt)

這里Rp為蛋白釋放率，k為蛋白釋放常數(shù)，t為破碎時間(min)。在面包酵母濃度為20mg/ml，超聲波頻率為20KHz，輸入功率190瓦的條件下，蛋白釋放常數(shù)k與輸入功率有如下關(guān)系:

k=b(p-po)/0.9

其中b為常數(shù)，p是輸入功率(J/kg.s)，po是空化作用的最低界限輸入功率。第31頁,共127頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用與局限

最大問題是在超聲過程中聲波被溶液吸收產(chǎn)生大量熱量，不能及時將熱量移出，細(xì)胞懸浮液的溫度急劇升高，導(dǎo)致酶和其它生物活性物質(zhì)變性失活。因此，在實驗室中往往采取間斷破碎的方法，即經(jīng)短時間破碎，冷卻降溫，再進(jìn)行破碎，經(jīng)多次反復(fù)達(dá)到破碎目的。因此在細(xì)胞破碎過程中，有效冷卻是關(guān)鍵。也因大容量容器的聲波傳遞和散熱困難，限制了超聲破碎的大規(guī)模應(yīng)用。第32頁,共127頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用與局限

超聲破碎在實驗室應(yīng)用比較普遍，處理量小時比較方便。超聲波作用產(chǎn)生游離基，超聲波會造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化均會使之失活。超聲破碎法細(xì)胞較為徹底，細(xì)胞內(nèi)含物全部釋放，破碎細(xì)胞懸浮液粘稠，利用簡單的過濾法難于回收含有目的產(chǎn)物的上清液，只有通過長時間離心回收上清液，使后序工藝復(fù)雜。超聲噪音污染環(huán)境，影響人們健康，應(yīng)對操作人員加以保護。第33頁,共127頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用與局限

在超聲破碎細(xì)胞時，正確的方法是探頭的下表面處于菌懸液表面下0.3-1.0cm處最好，深淺以不會使菌懸液產(chǎn)生大量泡沫為準(zhǔn)。超聲破碎細(xì)胞的破碎率一般可達(dá)到80-90%，如要進(jìn)一步提高破碎率，需增加更多的破碎時間。因后期破碎率提高并不明顯，且增加時間和能耗，更重要的是目的產(chǎn)物會因失活而使產(chǎn)物收率反而下降。從回收目的產(chǎn)物的角度看是不經(jīng)濟的。因此有必要通過破碎時間與破碎率和生物活性產(chǎn)物收率關(guān)系曲線確定最佳破碎時間。第34頁,共127頁，2024年2月25日，星期天大規(guī)模應(yīng)用的對策

大規(guī)模連續(xù)破碎細(xì)胞的超聲破碎系統(tǒng)示意圖

A超聲波轉(zhuǎn)換器，B細(xì)胞破碎腔，C細(xì)胞懸浮液儲存器，D冷凍系統(tǒng)，E高頻電發(fā)生器

關(guān)鍵是破碎腔的設(shè)計。腔的大小及深度要能夠被超聲波覆蓋，且料液無流動死角。操作要求嚴(yán)格控制細(xì)胞懸浮液和冷凍液的流速，以保證破碎流出物料的溫度不超過控制水平。采用批式多次單循環(huán)或連續(xù)混合循環(huán)方式均可達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。

第35頁,共127頁，2024年2月25日，星期天高壓釋放勻漿法

第36頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備與機理

高壓釋放勻漿法是一種有效的大規(guī)模破碎細(xì)胞技術(shù)。有各種類型的工業(yè)產(chǎn)品可供選擇，主要由高壓泵和釋放閥兩部分組成。高壓泵一般是一級或二級的正向柱塞泵，細(xì)胞懸浮液在40-350Mpa的高壓下通過閥座中心孔高速噴出，因針狀調(diào)節(jié)閥的阻擋而改變方向，噴射在碰撞環(huán)上，細(xì)胞在高速噴射，湍流碰撞和急劇降壓中，由于各種剪切力的作用致使細(xì)胞破碎。

高壓釋放閥示意圖A.控制卸壓的手柄,B.控制桿,C.針閥,D.閥座,E.碰撞環(huán)第37頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備與機理

釋放閥的結(jié)構(gòu)，特別是閥座的形狀對細(xì)胞破碎率有明顯影響。在相同的操作壓力下破碎啤酒母細(xì)胞時，刃式結(jié)構(gòu)要比平式結(jié)構(gòu)的破碎率高20-25%。.兩種閥座結(jié)構(gòu)的示意圖

a.平式結(jié)構(gòu),b.刃式結(jié)構(gòu)第38頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備與機理

高壓釋放破碎細(xì)胞機理的研究表明，致使細(xì)胞破碎的原因比較復(fù)雜。對產(chǎn)元假絲酵母和啤酒酵母細(xì)胞破碎機理的研究發(fā)現(xiàn)由于高速流動造成的碰撞是細(xì)胞破碎的主要原因，而一般的應(yīng)力切變造成的細(xì)胞破碎約只占總破碎力的20%，其它的作用力較難估計。

碰撞和一般應(yīng)力對細(xì)胞破碎的影響○碰撞,△一般應(yīng)力第39頁,共127頁，2024年2月25日，星期天影響破碎的因素

所有微生物細(xì)胞只有施加的壓力達(dá)到某一水平時才開始破碎，繼之細(xì)胞破碎率隨著壓力的增加而迅速增加。破碎為一級動力學(xué)過程：

ln[1/(1-R)]=kNPa

N為通過勻漿器閥門的次數(shù)，P為操作壓力，k為與溫度有關(guān)的速度常數(shù)，a為功率值，它與細(xì)胞破碎時需要克服的壓力范圍有關(guān)。

利用高壓勻漿器破碎面包酵母的破碎曲線

□溫度為30℃,○溫度為5℃第40頁,共127頁，2024年2月25日，星期天影響破碎的因素

破碎過程中，在很寬的范圍內(nèi)破碎與細(xì)胞濃度(29-224g/L的干細(xì)胞)無關(guān)。面包酵母破碎時，不同酶的釋放速度不同，集積在細(xì)胞壁和胞間質(zhì)的酶的釋放要比可溶性蛋白質(zhì)快些，而在線粒體上的酶的釋放與可溶性蛋白質(zhì)具有相同的速度，在亞細(xì)胞顆粒上的酶的釋放速度要慢些。

蛋白與酶釋放的相互關(guān)系

A.酸性磷酸酯酶,B.蔗糖酶,C.葡萄糖-5-磷酸,D.醇脫氫酶,E.堿性磷酸酯酶,F.富馬酸酶.第41頁,共127頁，2024年2月25日，星期天影響破碎的因素

酵母細(xì)胞在30℃破碎的破碎率大約比5℃的破碎率高1.5倍。因此,在不影響酶活力回收的前題下，適當(dāng)提高破碎溫度對破碎是有利的。高壓消耗的能量大部分轉(zhuǎn)化為熱量。在200MPa下壓縮1ml菌懸液釋放熱量47卡，可提高溫度47℃。因此，在實際操作時，為防止溫度過高，需要冷卻控制破碎操作溫度。不同微生物細(xì)胞因其形態(tài)，大小，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，在破碎時需要的壓力不同。下表列出了不同微生物細(xì)胞達(dá)到50%破碎率所需要的壓力。

第42頁,共127頁，2024年2月25日，星期天影響破碎的因素微生物格蘭氏菌大小(μm)破碎50%所需壓力(Pa)大腸桿菌陰性

2-4×0.51.5×107枯草芽孢桿菌陽性

1.5-3×0.5-0.82.4×107干酪乳桿菌陽性

4×0.4-0.73.1×107糞鏈球菌陽性

Φ1.021.5×108金黃葡萄球菌陽性

Φ1.01.9×108釀酒酵母陽性

7-12×5-81.5×108破碎不同微生物細(xì)胞需要的壓力

第43頁,共127頁，2024年2月25日，星期天影響破碎的因素

細(xì)胞破碎率與培養(yǎng)條件和生長期有關(guān)。生長在合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌要比生長在復(fù)雜培養(yǎng)基上的易破碎；對數(shù)生長期中期收獲的細(xì)胞要比對數(shù)生長期后期收獲的細(xì)胞易破碎。細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件對破碎的影響

1.批式培養(yǎng)的產(chǎn)元假絲酵母2.連續(xù)培養(yǎng)的產(chǎn)元假絲酵母3.好氣培養(yǎng)的啤酒酵母4.厭氣培養(yǎng)的面包酵母5.連續(xù)培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌第44頁,共127頁，2024年2月25日，星期天影響破碎的因素

高壓釋放破碎細(xì)胞雖然也存在細(xì)胞破碎釋放原生質(zhì)物質(zhì)使破碎物粘度不斷增加，改變流變學(xué)性質(zhì)的問題，但因不會發(fā)生細(xì)胞壁降解而形成更小的碎片和釋放細(xì)胞壁糖原，避免了破碎物粘度的進(jìn)一步增加，因此對后序工藝的影響較小。細(xì)胞破碎率與細(xì)胞懸浮液通過勻漿器的次數(shù)成正比，因每次破碎率有限，在實際操作中可以采用批式循環(huán)或混合循環(huán)方式。為控制破碎溫度，需在細(xì)胞懸浮液儲罐進(jìn)行冷卻降溫。在細(xì)胞懸浮液中加入細(xì)玻璃珠，或冷凍細(xì)胞懸浮液形成適當(dāng)量的冰晶，可提高細(xì)胞破碎率。第45頁,共127頁，2024年2月25日，星期天冰凍壓縮釋放破碎法

第46頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備與機理

冷凍的細(xì)胞懸浮液在低溫低壓力下不能流動，但提高壓力時，水的結(jié)晶結(jié)構(gòu)會發(fā)生相變，隨著壓力的增高，水的結(jié)晶內(nèi)聚性降低，從不能流動的固相變成可流動的液相；在高壓下發(fā)生流動噴射，使細(xì)胞破碎。

壓力與溫度對水的相圖的影響

第47頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備與機理冷壓釋放破碎器結(jié)構(gòu)示意圖

1.活塞，2.尼龍殼，3.園桶環(huán)，4.柱塞，5.壓縮腔內(nèi)的細(xì)胞懸浮液，6.O-型環(huán)，7.園盤，8.園盤支架，9.固定栓，10.空氣閥，11.螺旋彈簧，12.網(wǎng).第48頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備與機理

破碎細(xì)胞操作中，物料從小孔噴射由壓力控制。只有壓力高于相變臨界壓力時，細(xì)胞懸浮液從固相轉(zhuǎn)變?yōu)橐合啵l(fā)生噴射。而噴射的結(jié)果是壓力急劇降低，低于相變臨界壓力，細(xì)胞懸浮液成為固相，噴射停止，壓力再度升高超過相變臨界壓力，再次噴射，周而復(fù)始，完成細(xì)胞破碎。

在園盤小孔上安裝調(diào)節(jié)控制壓力閥，使破碎在更高壓力下進(jìn)行。如將細(xì)胞懸浮液冷凍到-20℃，施以200Mpa壓力，可將釀酒酵母細(xì)胞一次破碎率達(dá)到90%。第49頁,共127頁，2024年2月25日，星期天技術(shù)適用性

由于在低溫下操作，對于熱敏感的生物活性物質(zhì)有利，破碎的活性收率要比其他破碎方法高。利用該破碎技術(shù)破碎格蘭氏陽性球菌和桿菌，分枝桿菌，放線菌，酵母和真菌提取酶均獲得很好結(jié)果，說明微生物種類，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形狀對破碎影響較小。該技術(shù)用于破碎原生動物，花粉，甚至動物細(xì)胞，也均獲得理想結(jié)果。破碎兔皮提取透明質(zhì)酸，不僅可避免與粗結(jié)構(gòu)結(jié)合，還可減少產(chǎn)物降解。將粗的動物組織，如皮和健切成幾毫米的小塊，與等量的水混合冷凍也可破碎。像軟組織，如肝，腎等也可直接進(jìn)行冷凍壓縮釋放破碎。因此與其它破碎技術(shù)相比，其適用范圍更寬。

第50頁,共127頁，2024年2月25日，星期天影響破碎的因素

酵母細(xì)胞懸浮液在-25℃破碎過程：活塞以0.95cm/秒的速度向前推進(jìn)，14~15秒后，壓力達(dá)到200Mpa以上，細(xì)胞懸浮物液化在壓力下通過釋放孔，高速噴射，發(fā)出'嘭'的一聲，壓力降到幾乎為零，測定的物料噴射速度高于200m/秒，0.15秒后，壓力上升接近原來的200Mpa，再次重復(fù)這一過程。因此，脈動的時間間隔為0.15秒，這段時間大部分是用于提高壓力。整個破碎過程為不連續(xù)脈沖釋放過程。酵母細(xì)胞破碎過程的壓力變化情況第51頁,共127頁，2024年2月25日，星期天影響破碎的因素

將釀酒酵母懸浮加入不同濃度的氯化鉀，氯化鈉和氯化鈣，分別在-15、-25、-35℃下進(jìn)行壓縮破碎，發(fā)現(xiàn)在鹽存在下，于-25℃和-35℃時破碎率較高；鹽的作用主要是改變相變的共熔點，降低釋放的臨界壓力(Po)。氯化鈣和氯化鈉比氯化鉀的作用明顯，在破碎中的影響也較大。

在-25℃下，使用不同濃度的酵母細(xì)胞進(jìn)行破碎，發(fā)現(xiàn)破碎率隨細(xì)胞濃度的增加而增加，至少細(xì)胞濃度可達(dá)到270mg/ml(干重)。高濃度的酵母細(xì)胞使懸浮液粘度增加，較低的相轉(zhuǎn)移速度和平滑的流動會產(chǎn)生較高的破碎。同時會延長脈沖的間隔時間。

第52頁,共127頁，2024年2月25日，星期天大量破碎微生物細(xì)胞的方法

為了大量破碎微生物細(xì)胞和其它生物材料，建立了半連續(xù)的操作方式。首先將細(xì)胞懸浮液在冷凍箱內(nèi)冷凍制成圓柱狀，其大小要適合加壓圓筒。將預(yù)先冷凍成形的物料放入破碎器，利用水泵加壓驅(qū)動活塞，使之通過小孔進(jìn)行破碎。一般樣品溫度為-35℃，加壓破碎溫度為-20℃，面包酵母以平滑流動方式通過小孔，一次破碎的破碎率可達(dá)到90%。每小時可處理20Kg材料，功效可達(dá)到20%，能量消耗為1KWh/Kg。如果再增加處理量也是可能的。第53頁,共127頁，2024年2月25日，星期天球磨破碎技術(shù)

第54頁,共127頁，2024年2月25日，星期天球磨破碎技術(shù)

球磨破碎細(xì)胞的破碎率可高達(dá)95%，用于提取細(xì)胞壁，線粒體，核酸，蛋白以及其它細(xì)胞器的收率也高。用Dynomill破碎酵母細(xì)胞提取線粒體的收率要比其它機械破碎法要高5-8倍。球磨破碎細(xì)胞應(yīng)用范圍廣，從實驗室到大規(guī)模生產(chǎn)均可使用，并可控制系統(tǒng)及破碎工藝過程的溫度；操作系統(tǒng)密閉，可對系統(tǒng)進(jìn)行滅菌，避免污染。因此，該技術(shù)和設(shè)備的發(fā)展和應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。第55頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備及原理

國際上不同生產(chǎn)廠家分別生產(chǎn)多種球磨破碎細(xì)胞的設(shè)備，從實驗室使用的小型細(xì)胞球磨機到大規(guī)模生產(chǎn)使用的每小時可破碎

100公斤細(xì)胞的大型細(xì)胞破碎機，多各種類型和規(guī)格。但基本原理和機械結(jié)構(gòu)大同小異。這里主要介紹瑞典的Dyno-mill機。

第56頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備及原理Dyno-mill細(xì)胞破碎機結(jié)構(gòu)示意圖

1為整體結(jié)構(gòu)圖，2為破碎室結(jié)構(gòu)圖，A破碎室夾套，B攪拌葉，C攪拌軸，D微孔分離器,E物料進(jìn)口,F溫度測試孔,G冷卻液進(jìn)口,H攪拌軸

第57頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備及原理球磨容器

實驗室規(guī)模的容積為0.15、0.3和0.6升，工業(yè)規(guī)模的為1.4升到15升，最大的可達(dá)265升，為帶有冷卻夾套的圓桶容器，小型的實驗室使用的是無鉛玻璃制造，而大型的是不銹鋼制造。有通向容器內(nèi)部的菌懸液進(jìn)料口和球磨劑裝料口。依靠夾具將其固定，很容易更換。驅(qū)動馬達(dá)

為三相380V，1.85KW，2900rpm的電動馬達(dá)。其主動輪通過一個特殊的V型皮帶與攪動軸上的被動輪連結(jié)，利用安裝在操作馬達(dá)開關(guān)板上的手柄，控制皮帶在主動輪和被動輪上的位置，改變攪動速度。分別達(dá)到2000，3000，4500和6000轉(zhuǎn)/秒，這時的攪拌葉的線速度分別為6.7，10，15和20米/秒。第58頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備及原理電動馬達(dá)的控制

控制馬達(dá)的開關(guān)有兩個按鈕，開和關(guān)，安培表，信號燈，在防護罩上有磁性開關(guān)，一當(dāng)防護罩打開，或在操作時未關(guān)上，電動馬達(dá)不能啟動。攪拌葉

由聚氨酯或不銹鋼制造的直徑為64毫米的圓盤，它們是用墊片和分離子按一定間隔距離將其固定在攪動軸上。

AB攪拌葉輪結(jié)構(gòu)示意圖

A聚氨酯葉輪

B不銹鋼葉輪第59頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備及原理分離器

為一種高效狹縫分離器，它的作用是將研磨劑保留在研磨容器內(nèi)，而使破碎的細(xì)胞懸浮液流出。狹縫的寬度是利用不同厚度的標(biāo)準(zhǔn)隔片控制，分別為0.02，0.05，0.1，0.2和0.3mm。狹縫大小的選擇取決于使用的研磨劑的粒度，一般為研磨劑直徑的三分之一。球磨劑球磨劑為無鉛玻璃制造的玻璃珠，直徑范圍最小的為0.1mm，最大的為1.5mm，可根據(jù)破碎的細(xì)胞種類進(jìn)行選擇。實驗結(jié)果表明在球磨容器內(nèi)的球磨劑裝量為研磨容器的容積的80-85%為宜。第60頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備及原理給料泵

為了連續(xù)破碎，可使用能調(diào)速的普通蠕動泵，將細(xì)胞懸浮液連續(xù)輸?shù)狡扑槠鲀?nèi)，其供料速度可由需要的破碎率來控制。冷凍設(shè)備由于在細(xì)胞破碎過程中高速攪拌，研磨劑與研磨劑，研磨劑與細(xì)胞之間的磨擦?xí)a(chǎn)生大量熱量，破碎過程溫度不斷升高，為避免生物活性物質(zhì)失活，對破碎系統(tǒng)進(jìn)行冷卻是十分必需的。對于Dtno-millKDL可配用DMK15/F型的循環(huán)流動式制冷機，對球磨容器和細(xì)胞懸浮液儲存器進(jìn)行冷卻。冷凍液可采用聚乙二醇/水溶液（1/1）。第61頁,共127頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備及原理破碎效能

當(dāng)使用0.3L的研磨容器時，采用連續(xù)破碎，最大的細(xì)胞懸浮液輸入量可達(dá)15L/h，而實際的輸入量要取決于破碎率。0.3和0.15L的破碎容器也可進(jìn)行批式破碎，主要適用于低粘度的懸浮液，如微生物材料，其一次裝量分別為160-170和80-85ml。而不銹鋼破碎球磨容器主要用于高速破碎和粘度高的懸浮液的破碎。第62頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞破碎原理及動力學(xué)

在高速細(xì)胞破碎球磨機內(nèi)，高速旋轉(zhuǎn)攪拌葉攪動細(xì)胞懸浮液和球磨劑--玻璃珠，由于切力層間的碰撞及球磨劑的旋輾而使細(xì)胞破碎。因此，細(xì)胞破碎的過程實為一級反應(yīng)動力學(xué)過程。如果以細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放來衡量破碎程度，蛋白質(zhì)釋放速度直接與未釋放的蛋白質(zhì)量成正比。

loge[Rm/(Rma-R)]=logeD=kt

R為某一時間測定的細(xì)胞破碎釋放的蛋白質(zhì)量，Rm

為總蛋白質(zhì)釋放量，k

為一級反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)。將上式對時間t

積分

D=Rm/Rma-R，即為未釋放蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)的倒數(shù)。若按細(xì)胞破碎率來表示，可寫成：

loge(Xma/1-X)=kt

這里Xma

為最大破碎率，X

是在時間t

時的破碎率。第63頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞破碎原理及動力學(xué)

按可溶性蛋白質(zhì)釋放的破碎動力學(xué)，則可寫為：

loge[Rm/(Rma-R)]=logeD=kt

若按實際測定的蛋白質(zhì)量Ro

表示，當(dāng)Ro=Rma

時，則

Ro=Rma

+k2/k1.K

按細(xì)胞破碎率來表示，可寫成：

loge(Xma/1-X)=kt

通過對破碎細(xì)胞的球磨機的示蹤研究表明，其動力學(xué)行為與連續(xù)攪拌反應(yīng)器(CSTR)很相似，因此，對Dyno-millKDL0.6的球磨過程可以認(rèn)為是由四個串聯(lián)的攪拌反應(yīng)器組成，即由四個攪拌葉構(gòu)成一個反應(yīng)器，相鄰的攪動葉輪距離較小，因此，存在反流現(xiàn)象，而使其效率略有降低。而5L的Dyno-mill，因反流現(xiàn)象可以忽略，因此破碎效率較高。第64頁,共127頁，2024年2月25日，星期天影響細(xì)胞破碎的因素及其相互關(guān)系

細(xì)胞種類及狀態(tài)

利用Dyno-millKDL進(jìn)行的細(xì)胞破碎試驗表明，不同中屬的微生物細(xì)胞在相同條件下破碎時，其破碎效率有明顯差異，如表。

菌種活菌數(shù)蛋白質(zhì)酶

最大破碎率(%)K(min-1)最大釋放量(mg/g.dl)K(min-1)最大釋放量（IU/g.dl）K(min-1)假單孢菌--66.01.146.21.6陰溝腸桿菌1001.399.01.5570.01.65大腸桿菌1001.7540.51.732.01.4酵母901.4654.01.545.01.3第65頁,共127頁，2024年2月25日，星期天影響細(xì)胞破碎的因素及其相互關(guān)系

上述差異的主要原因是不同種屬的微生物細(xì)胞的大小和形態(tài)，細(xì)胞壁或膜的結(jié)構(gòu)不同，另外，因生長條件如培養(yǎng)溫度，時間，營養(yǎng)成份不同使上述的細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等也有差別。因此，即使在相同的破碎條件下其破碎效果也不同。換句話說，不同種屬的微生物細(xì)胞所需的破碎條件也不相同。從大量文獻(xiàn)中可以總結(jié)出這樣的規(guī)律：按細(xì)胞破碎的難易程度是細(xì)菌＜酵母＜真菌＜藻類。另外，細(xì)胞的保存情況也會影響破碎效果，

保存狀態(tài)破碎程度(%)5(min)10(min)15(min)噴霧干燥559197新鮮8799100第66頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞濃度

在細(xì)胞破碎前，需用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)，比如緩沖液按細(xì)胞重量配制成一定細(xì)胞濃度的懸浮液。懸浮液要均勻，要防止有結(jié)塊和沉淀。初始的細(xì)胞濃度對破碎速率的影響如圖。破碎速度常數(shù)(K)與酵母濃度的關(guān)系

不銹鋼攪拌葉，聚氨酯攪拌葉

第67頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞濃度

一級反應(yīng)動力學(xué)的速成常數(shù)應(yīng)當(dāng)與細(xì)胞濃度無關(guān)，但在較高細(xì)胞濃度下，破碎過程細(xì)胞內(nèi)含物不斷釋放使系統(tǒng)粘度不斷升高，混合速度降低，導(dǎo)致破碎速率下降。在高細(xì)胞濃度下，最大蛋白質(zhì)釋放量(Rm)降低，但破碎率高。低細(xì)胞濃度下，細(xì)胞的總蛋白質(zhì)釋放量高，并受流出速度影響較?。桓呒?xì)胞濃度下，細(xì)胞的總蛋白質(zhì)釋放量降低，特別是在高流出速度下，總蛋白質(zhì)釋放量隨細(xì)胞濃度增加而下降。

酵母濃度對蛋白質(zhì)釋放的影響△▲不銹鋼攪拌葉，▲●流速為100×10-6m3/sec○●聚氨酯攪拌葉，△○流速為20×10-6m3/sec第68頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞濃度

除了細(xì)胞濃度直接影響破碎物的粘度以外，細(xì)胞的保存狀態(tài)也影響著粘度和破碎率。

細(xì)胞濃度與保存狀態(tài)對粘度的影響◆鮮細(xì)胞■干細(xì)胞第69頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞濃度

細(xì)胞破碎過程中，由于粘度增加，熱傳導(dǎo)能力降低，即使在相同的冷卻條件下，破碎系統(tǒng)的溫度也會增高，溫度的增高會引起蛋白質(zhì)和酶變性，使蛋白質(zhì)和酶的總釋放量降低。

細(xì)胞濃度對破碎溫度的影響◆玻璃研磨室■不銹鋼研磨室

第70頁,共127頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞濃度

總之，在Dyno-mill上進(jìn)行細(xì)胞破碎，細(xì)胞濃度從20%增加到40%，破碎速度常數(shù)僅有很小的變化;細(xì)胞濃度增加到50%，破碎速度常數(shù)減小，破碎效率降低。高細(xì)胞濃度下，還會發(fā)生細(xì)胞破碎物沉淀和蛋白質(zhì)沉淀現(xiàn)象．一般來說，破碎細(xì)胞濃度以40%為宜。

第71頁,共127頁，2024年2月25日，星期天球磨劑

最常使用的球磨劑是無鉛玻璃珠，其它的還有不銹鋼珠，聚酯和聚酰胺珠等。

球磨劑顆粒大小的影響一般使用的無鉛玻璃珠的直徑為0.1~1.5mm，利用大腸桿菌和酵母細(xì)胞進(jìn)行實驗發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞破碎率隨玻璃珠直徑的增加而降低。對于不同的細(xì)胞，由于其大小不同，使用的玻璃珠的最適直徑也不同。大腸桿菌和陰溝腸桿菌使用0.1mm的玻璃珠進(jìn)行破碎的效率最高；而酵母細(xì)胞使用0.25~0.5mm的研磨劑最宜。第72頁,共127頁，2024年2月25日，星期天球磨劑

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和各種酶的釋放速度常數(shù)與玻璃珠直徑的關(guān)系如圖，說明酵母細(xì)胞破碎的最適玻璃珠直徑為0.25~0.5mm。玻璃珠直徑對破碎速度常數(shù)的影響■酶▲蛋白質(zhì)

第73頁,共127頁，2024年2月25日，星期天球磨劑

破碎率與玻璃珠大小和物料流速的關(guān)系如圖，說明破碎率隨使用的玻璃珠直徑的增加和物料流速的增加而降低。玻璃珠大小與流速對破碎率的影響第74頁,共127頁，2024年2月25日，星期天球磨劑

實際操作時，一般不使用0.1mm的球磨劑，即使破碎細(xì)菌也使用0.25~0.5mm的玻璃珠。其原因有三：一、用0.1mm的玻璃珠破碎速度雖高，時間短，若破碎時間控制不嚴(yán)，對酶有破壞作用，破碎物的酶活會下降；二、小珠機械研磨產(chǎn)生熱量高；三、選擇狹縫分離器時，狹縫的大小應(yīng)當(dāng)是使用的研磨劑直徑的三分之一，使用0.1mm的玻璃珠，狹縫應(yīng)選用0.03mm的，這樣的狹縫分離很慢，大規(guī)模破碎時很困難。玻璃珠作球磨劑，使用100h的損失不超過3%，一年后檢查分離器通道無重大變化，說明玻璃珠可以長期反復(fù)使用。

還發(fā)現(xiàn)使用的玻璃珠大小與酶在細(xì)胞內(nèi)的位置及細(xì)胞濃度有關(guān)。

第75頁,共127頁，2024年2月25日，星期天球磨劑裝量的影響

使用無鉛玻璃珠作球磨劑，一般的裝量為研磨容器容積的80~85%。隨球磨劑裝量的降低，細(xì)胞破碎效率也降低，同時研磨過程中產(chǎn)生的熱量也減少。因此，如果破碎釋放的活性物質(zhì)不耐熱，而且設(shè)備冷卻又差，需適當(dāng)減少球磨劑的裝量。另外，若細(xì)胞懸浮液或破碎物的粘度很高時，也需適當(dāng)降低球磨劑的裝量。第76頁,共127頁，2024年2月25日，星期天球磨劑攪動速度

Dyno-mill的攪動軸有四個轉(zhuǎn)速，即2000，3000，4500和6000r/min，相應(yīng)的攪拌葉輪的線速度為6.9，10，15和20m/s。在球磨細(xì)胞破碎過程中，馬達(dá)驅(qū)動軸帶動攪拌葉轉(zhuǎn)動是細(xì)胞破碎的維一能量來源。因此，攪拌葉的轉(zhuǎn)速決定著細(xì)胞破碎的速度和程度。大多數(shù)試驗證明，細(xì)胞破碎速率隨攪拌葉轉(zhuǎn)速的增加而增加，但在很高的轉(zhuǎn)速下細(xì)胞破碎速率不會成比例增加，有時還可能下降。第77頁,共127頁，2024年2月25日，星期天攪動速度

酵母細(xì)胞破碎過程中，酶的釋放速度常數(shù)隨葉輪轉(zhuǎn)動速度的增加而增加。胞間質(zhì)酶，在細(xì)胞破碎過程中容易釋放，細(xì)胞器結(jié)合酶，只有細(xì)胞完全破碎才釋放出來。液輪攪動速度對蛋白質(zhì)釋放速度常數(shù)的影響○蛋白質(zhì),△麥芽糖酶,□磷酸酯酶,●MDH,▲G6PDH,■6GPDH.第78頁,共127頁，2024年2月25日，星期天攪動速度Dyno-mill的容積及攪動葉輪的材質(zhì)上的差異，以及操作方式的差異，攪動速度對細(xì)胞破碎的影響也有差異。但總的趨勢相同，即攪動速率增加，破碎的速度常數(shù)也增加。攪動速度、葉輪材質(zhì)和操作方式對破碎速率的影響△批式，5L破碎室，不銹鋼攪拌葉○批式，●連續(xù)，0.6L破碎室，聚氨酯攪拌葉，▲連續(xù)，▽批式第79頁,共127頁，2024年2月25日，星期天攪動速度

實際上，攪拌葉的攪動速度的增加使破碎加快，也使整個系統(tǒng)的溫度升高。

攪拌速度(m/s)溫度(℃)

開始溫度終了溫度1013~41517~822.5121是在有冷卻的條件下進(jìn)行的，攪動速度的增加造成溫度升高；盡管高速攪動可以獲得高的破碎速度，但對某些對熱敏感的活性物質(zhì)來說就受到限制。

第80頁,共127頁，2024年2月25日，星期天

葉輪結(jié)構(gòu)

經(jīng)常使用的攪動葉輪有兩種，一種是由聚氨基甲酸酯材料制造，具有開放式的結(jié)構(gòu)；另一種是用不銹鋼制造的，結(jié)構(gòu)上不如聚氨基甲酸酯的開放。

在5L破碎容器中不同材質(zhì)的攪拌葉對破碎效率的影響

○

聚氨基甲酸酯

△

不銹鋼

第81頁,共127頁，2024年2月25日，星期天葉輪結(jié)構(gòu)

不同材質(zhì)和結(jié)構(gòu)的攪動葉輪在操作中因攪動效果的差異，使破碎系統(tǒng)的溫度變化也不同。流速(m3/sec)溫度升高(℃)

不銹鋼葉輪聚氨酯葉輪83×10-616.517.053×10-617.019.542×10-618.022.022×10-620.028.0該結(jié)果表明具有開放結(jié)構(gòu)的聚氨酯攪拌葉的攪動效率高，物料球磨效果好，因而升溫也比不銹鋼葉輪的高些。

第82頁,共127頁，2024年2月25日，星期天葉輪結(jié)構(gòu)在低轉(zhuǎn)速下，較開放的聚氨酯葉輪的破碎效率較低，這是由于反逆作用所造成的。在高轉(zhuǎn)速下，有較高的攪動效率，且能耗也增加。為增加攪動效率，可以使攪拌葉安裝成與軸有一定角度，其作用是增加分散能力，但這樣會使連續(xù)破碎的能力減??；因增加了能量到細(xì)胞懸浮液中的傳遞能力，而有較高的破碎速度，但能量效率降低，特別是在高轉(zhuǎn)速下。第83頁,共127頁，2024年2月25日，星期天葉輪結(jié)構(gòu)

葉輪結(jié)構(gòu)和材質(zhì)上的差異造成功率消耗不同，

葉輪形狀,轉(zhuǎn)速和驗?zāi)デ坏娜莘e對功率消耗的影響●聚氨基甲酸酯攪拌葉▲不銹鋼攪拌葉具有較開放結(jié)構(gòu)的聚氨酯葉輪的功率消耗高于結(jié)構(gòu)上較封閉的不銹鋼葉輪，不論是在容積較大的，還是在容積較小的球磨破碎機上均是如此。

第84頁,共127頁，2024年2月25日，星期天葉輪結(jié)構(gòu)一個球磨機的效率可用以下公式計算:Eff=RYQ/P這里R為每kg細(xì)胞釋放的蛋白量，Y是細(xì)胞濃度，Q為流速，P為動力消耗。在5.0L的Dyno-mill上，使用聚氨基甲酸酯攪拌葉和不銹鋼攪拌葉時的動力效率與流速和攪動速度的關(guān)系如圖。

聚氨基甲酸酯葉輪的操作動力效率不銹鋼葉輪的操作動力效率第85頁,共127頁，2024年2月25日，星期天葉輪結(jié)構(gòu)

以上結(jié)果說明用聚氨酯攪拌葉操作時，球磨的動力效率隨流速和葉輪轉(zhuǎn)速的減小而增加；而用不銹鋼攪拌葉時，以轉(zhuǎn)速10m/sec的速度運轉(zhuǎn)操作，破碎的動力效率最高，當(dāng)流速降低時，動力效率也降低，但總的趨勢變化不大。

在0.6L的破碎容器上與5.0L的不同。由于縱向分散和反流的增加，使相對的反應(yīng)器有效數(shù)目減少，引起球研磨破碎產(chǎn)率的降低。因此，在低流速和長時間停留的情況下特別有效。顯然，引起增加分散的因素不能增加破碎速率。在0.6

L的破碎容器中，隨流速的增加動力效率會陡然減弱，增加攪拌葉轉(zhuǎn)速會引起破碎速率的增加。但用增加分散來改進(jìn)產(chǎn)率的效果不明顯。

第86頁,共127頁，2024年2月25日，星期天流速

在連續(xù)的細(xì)胞破碎過程中，流速決定著細(xì)胞在破碎容器中的存留時間，直接影響著破碎系統(tǒng)的溫度和破碎程度。

流速(l/h)流出液溫度(℃)酶活性(IU/g細(xì)胞)蛋白(mg/g細(xì)胞)比活(IU/mg蛋白質(zhì))72529.450.00.588152629.443.40.6772015.527.742.40.653數(shù)據(jù)表明隨著流速的增加，破碎系統(tǒng)的溫度會較低；釋放蛋白質(zhì)量降低，酶量降低，比活增高。

第87頁,共127頁，2024年2月25日，星期天流速流速增加，蛋白質(zhì)的釋放速度常數(shù)也降低。在不同攪拌速度下細(xì)胞懸浮液流速對各種酶釋放的影響第88頁,共127頁，2024年2月25日，星期天流速

細(xì)胞破碎與攪動速度有關(guān),在高攪動速度下，流速的變化對細(xì)胞破碎率影響較小，而在低的攪動速度下，流速對破碎率的影響較大。細(xì)胞懸浮液流速與攪動速度對細(xì)胞破碎率的影響第89頁,共127頁，2024年2月25日，星期天時間

在批式破碎過程中，破碎時間直接影響著細(xì)胞破碎的程度，以及蛋白質(zhì)和酶的釋放。

細(xì)胞破碎過程中實測的酶釋放曲線細(xì)胞破碎時間過長，酶會發(fā)生失活。因此，破碎時間要適當(dāng)掌握。另外，不同酶在細(xì)胞中所處的位置有差異，細(xì)胞破碎時酶的釋放速度不同，細(xì)胞器結(jié)合的酶釋放較慢，而細(xì)胞的總蛋白質(zhì)的釋放可能比某些酶的釋放要快，為了獲得較高的比活，也要控制破碎時間。第90頁,共127頁，2024年2月25日，星期天溫度

目前還沒有溫度對破碎過程影響的詳細(xì)研究報告，由于破碎為產(chǎn)熱過程，直接影響破碎物的粘度及酶的活性和蛋白質(zhì)總量的釋放，一般來說，破碎溫度越高，細(xì)胞蛋白質(zhì)的釋放量越低，

.溫度對蛋白質(zhì)釋放的影響

由此可見，破碎過程加強冷卻循環(huán)，降低破碎系統(tǒng)的溫度是必須的。第91頁,共127頁，2024年2月25日，星期天幾個典型實例細(xì)菌細(xì)胞的破碎

(1)批式破碎條件參數(shù)細(xì)菌大腸桿菌研磨劑玻璃珠1-1.4μm

1.4μm

0.7×0.25μm

破碎容器玻璃260ml260ml260ml

裝量150ml細(xì)胞懸浮液攪拌葉轉(zhuǎn)速2000r/min相當(dāng)于10m/sec

進(jìn)口溫度0℃0℃0℃

出口溫度2-3℃2-3℃4-5℃

時間14min12min12min

破碎程度活的格蘭氏染色細(xì)胞減少到0.001%

冷凍液溫度-9℃

冷凍液流速150L/h第92頁,共127頁，2024年2月25日，星期天幾個典型實例

酵母細(xì)胞破碎

(1)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)

批次123

細(xì)胞懸浮液組成干物料含量14.2%,水,pH7.0

細(xì)胞大小6-8μm同同破碎腔容積0.3L同同操作方式批式同同研磨劑無鉛玻璃珠,直徑0.25-0.5nm

裝量玻璃珠256ml,細(xì)胞懸浮液150ml

冷卻液溫度-8℃,用鹽溶液同冷卻液流速200升/小時同同料液進(jìn)口溫度2℃2℃2℃

料液出口溫度4℃5℃5-6℃

破碎時間(min)123

破碎率(%)819699.5

第93頁,共127頁，2024年2月25日，星期天幾個典型實例真菌

(1)青霉菌(penicilliumsp.)

細(xì)胞懸浮液組成干物料含量5%,水細(xì)胞大小纖維狀破碎腔容積0.6L

操作方式連續(xù)研磨劑無鉛玻璃珠,直徑0.5-0.75nm

裝量玻璃珠510ml

攪動速度4500r/min,相當(dāng)于15m/sec

分離器寬0.1ml

冷卻液溫度自來水料液進(jìn)口溫度16℃

料液出口溫度36℃

料液流速(L/h)3

破碎率(%)100第94頁,共127頁，2024年2月25日，星期天幾個典型實例藻類

批次123

細(xì)胞懸浮液很粘,水同同細(xì)胞大小10-15μm同同破碎腔容積0.3L同0.6L

操作方式批式同連續(xù)研磨劑無鉛玻璃珠,直徑0.25-0.5nm510ml

裝量玻璃珠260ml,細(xì)胞懸浮液150ml

攪動速度10m/sec15m/sec75m/sec

分離器0.05nm同同冷卻液溫度自來水,同同冷卻液流速200L/h同同料液進(jìn)口溫度16℃16℃18℃

料液出口溫度18℃21℃24℃

料液流速(L/h)6

破碎時間(min)11

破碎率(%)100100100第95頁,共127頁，2024年2月25日，星期天研磨法第96頁,共127頁，2024年2月25日，星期天原理

最早在實驗室用的研磨法是使用氧化鋁，也可用細(xì)玻璃粉或石英粉作為研磨劑，其顆粒大小為0.1nm。先將細(xì)胞和研磨劑按1比5的比例混合均勻，預(yù)冷后放入研缽，手持研磨杵進(jìn)行研磨。依靠在壓力下推動固體與細(xì)胞的擠壓與磨擦使細(xì)胞壁破碎。該法簡便，但效率低，處理量小。只能在實驗室中使用。根據(jù)這個原理,設(shè)計了細(xì)菌磨。細(xì)菌磨結(jié)構(gòu)示意圖

主要由研磨和動力兩部分構(gòu)成。研磨部分包括滾筒和承座。滾筒是長15cm，直徑5cm，厚度為2nm以上的硬質(zhì)磨砂玻璃管；承座是能與玻璃滾筒的半面密切貼合的凹型硬質(zhì)瓷座。玻璃滾筒兩端用橡皮塞密封，一端帶有被動輪的鋼軸通過橡皮塞中心貫穿玻璃滾筒，滾筒與瓷承座不但要密切吻合，且必須互相貼緊。因此，在瓷承座下必須墊以強有力的彈簧或富有彈性的橡膠。玻璃滾筒內(nèi)可加入冰塊，以便降溫；瓷承坐也可制成中空的，接上進(jìn)出口，可以通入冷卻水，以便控制研磨細(xì)胞時的溫度。動力部分是一小馬達(dá)，由皮帶與被動輪傳動，減速后，滾筒轉(zhuǎn)速為120-130r/min。第97頁,共127頁，2024年2月25日，星期天操作

將濕菌體與1.3-1.5倍重量的直徑在3mm以下的玻璃粉研磨劑共置一研缽內(nèi)，冷卻至5℃以下，迅速將玻璃粉和濕細(xì)胞混合均勻，研壓成塊，用不銹鋼勺取5g左右