脆性概述課件

脆性X染色體綜合征4/17/20241脆性X染色體綜合征（FragileXSyndrome)脆性X綜合征（MIM:309550）是－種發(fā)病率僅次于先天愚型的遺傳性智力低下綜合征，發(fā)病率占全部兒童的0.05%,呈X連鎖遺傳,占X連鎖智力低下的40%。其外顯率因性別不同有差異，男性80％，女性30％。4/17/20242臨床表現(xiàn)男性患者：智力障礙、行為異常、語言反復，還有青春期大睪丸、顏面狹長、前額及下頜突出等體貌特征。4/17/20243女性患者：

由于女性有兩條X染色體，異常X染色體隨機失活，故其智力低下程度較輕，多有行為及情感異常，體征亦不如男性患者明顯。4/17/20244*KennesonA,WarrenST.Semin

ReprodMed,2001,19(2)andMonnier-BarbarinoP,ForgesT.JGynecol

Obstet

Biol

Reprod(Paris),2002,31

(4)

前突變：一般前突變攜帶者不出現(xiàn)癥狀，但最近研究表明，女性攜帶者可能出現(xiàn)卵巢功能可能不正常，攜帶者女性有較高的出生雙生子傾向,也可能有早熟卵巢衰竭(POF)和過早絕經*。4/17/20245

最新的研究確認，一些老年的前突變攜帶者中有進行性的嚴重震顫和行走平衡困難等癥狀，一般是一些脆性X染色體綜合征的患者的祖父。稱這種疾病為脆性X染色體相關震顫/共濟失調綜合癥FragileX-associatedTremor/AtaxiaSyndrome(FXTAS)4/17/20246雖然該疾病是與脆性X染色體綜合征完全不同的一種神經性疾病，且患者也完全不同，但兩種疾病都是由同一基因引起，因此對了解該基因的功能有重要意義。4/17/20247孤獨癥：◆確診的孤獨癥患兒中有大約4%~6%是由脆性X染色體綜合征引起◆有三分之一的脆性X染色體綜合征患兒有孤獨癥◆脆性X染色體綜合征是已知的引起孤獨癥的最常見原因

任何孤獨癥患者都應當進行脆性X染色體綜合征檢查。4/17/20248脆性X染色體綜合征產生的機制1943年Martin和Bell于倫敦首次報道了這種X連鎖的智力低下家系，即發(fā)現(xiàn)兩個智力正常的兄弟通過其各自健康的女兒出生了９個具智力低下與寬大臉龐和下頜的兒子1969年Lubs在低葉酸培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了長臂末端具隨體樣結構的X染色體。1977年Sutherland證明了這個罕見的葉酸敏感脆性部位FRAXA位于Xq27.3。1991年Verkerk等用定點克隆技術在Xq27.3附近發(fā)現(xiàn)了脆性X智力低下基因－FMR1

細胞遺傳學的脆性部位是FMR1基因突變的－個直接的細胞學標記，是因為(CGG)n大量擴展和甲基化干預了DNA的復制和染色質縮合，或兩者共同作用所引起。4/17/2024995％以上的脆性X綜合征發(fā)病的分子遺傳學基礎是FMR1基因(CGG)n結構擴增的動態(tài)突變。

5％以下是由于FMR1基因的錯義突變和缺失型突變影響了FMRP的正常結構導致的。4/17/202410

normalcontrols(N)premutation

carriers(P)fullmutationpatient(F)4/17/202411FMR1基因的結構

TheFMR1gene,depictingtheK-proteinhomology(KH)domainsandtheArg-Gly-Glytriplet(RGG)box,involvedinRNAbinding,thenuclearlocalizationsignal(NLS),transportingtheproteinintothenucleus,thenuclearexportsignal(NES;theconsensussequenceLRLERLQIDisindicated),exportingtheproteinfromthenucleus,andcoiledcoil(CC)domains,involvedinprotein–proteininteractions.Inaddition,theI304Nmissensemutationfoundinasingle,mostseverelyaffectedpatientisindicated.**R.FrankKooy,RobWillemsenandBenA.Oostra，MOLECULARMEDICINETODAY,MAY2000(VOL.6)4/17/202412脆性X染色體綜合征的檢查細胞遺傳學的檢查是確定診斷的重要方法。通常在低或無葉酸和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)待診者的標本。據Yunis報道，5-氟氧尿苷和咖啡因相繼處理可使Fra(X)表達率增高，但大量實驗證明，即使在最理想的培養(yǎng)條件下，也不可能在帶脆性X染色體的所有中期細胞分裂相中均能發(fā)現(xiàn)Fra(X)染色體，通常不超過50%4/17/202413在脆性X染色體綜合征的家系中，男性患者絕大多數(shù)有Fra(X)表達，表達率為2-60%；正常表型的男性也可有Fra(X)陽性，成為正常表型的男性傳遞者女性雜合子中，一種為智力低下者，有Fra(X)表達，其表達率可達7~41%；另一種為智力正常的攜帶者，常無Fra(X)表達，即使有表達者，表達率低于5%4/17/202414女性中FRA(X)表達率與智力低下程度呈正相關，與年齡呈負相關，男性中無這種相關關系Fra(X)的表達有遺傳異質性，即在某些家系的表達率高于另一些家系。4/17/2024154/17/2024164/17/202417FRAXA附近存在多個脆性位點：FRAXE(Xq28)FRAXF(Xq末端)

FRAXD(Xq27.2)Xq26在觀察時應仔細區(qū)分4/17/202418分子遺傳學檢查

DNA連鎖分析

RFLPs

連鎖分析已逐步由應用二核苷酸序列進行家系連鎖分析所取代。FMR1基因兩側有3個二核苷酸重復序列FraXAC1、FraXAC2、DXS548可作為遺傳指標。

優(yōu)點：對于DNA樣品量少，又無法重新獲取的產前診斷病例和成員眾多大家系的篩查，可以用這種連鎖分析方法縮小檢測范圍，簡化調查過程。 缺點：脆性X綜合征的遺傳方式非常復雜，具有與一般遺傳病完全不同的特殊遺傳規(guī)律：（1）前突變母親傳給子女時（CGG）n有擴展趨勢；（2）前突變父親，父女傳遞時（CGG）n有縮減趨勢;（3）全突變女性傳男性后代時（CGG）n有擴展趨勢，傳女性后代時（CGG）n有縮減趨勢。所以連續(xù)分析不能確切反映（CGG）n擴展的數(shù)量。4/17/202419Souhern

印跡雜交法 應用Southern印跡雜交即基因組DNA經雙酶酶切與基因內探針StB12.3等雜交,分析雜交后DNA片段大小,可了解(CGG)n重復數(shù),以及CpG島甲基化程度來診斷攜帶者及患者。此法是目前診斷FraX

的主要方法4/17/202420a)230to780repeatsincase1(and130inonelaboratory)

b)26

to

32

repeats

in

case

2c)51

to

76

repeats

in

case

3

(and

130

in

one

laboratory)*

*ThefinalreportofEMQN

2004

External

Quality

A-ssessmentscheme

for

FRAX

testing4/17/202421該法需同位素標記,技術繁雜費時,且存在同位素污染問題,不易于基層推廣應用,亦不宜于群體篩查。使用時還應注意酶解完全,否則產生的雜交帶可致錯誤的診斷。近年來用地高辛標記引物進行Southern印跡雜交取得了很大進展,不僅快速而且避免了同位素污染*

*GoldB,RaduD,BalankoA,etal.MolDiagn,2000,5(3)4/17/202422PCR法

Fu等人最先將PCR法用于(CGG)n重復拷貝數(shù)的檢測。應用(CGG)n重復序列兩側引物直接擴增包括(CGG)n重復區(qū)域在內的DNA片段,其產物經瓊脂糖或變性序列膠電泳分離,轉印后與同位素或非同位素標記的寡核苷酸探針雜交,可檢測擴增產物;也可用銀染方法直接檢測PCR產物,即可精確測定重復拷貝數(shù);還可在PCR反應體系內摻入同位素標記的某種脫氧單核苷酸(如32P-dCTP),再經變性序列膠電泳分離,放射自顯影得到PCR產物但當重復拷貝數(shù)超過200,擴增就較困難4/17/202423

PCR不僅能夠快速簡便地確定(CGG)n拷貝數(shù),而且采用多對引物可以檢測FMR-1基因的缺失和點突變,RT-PCR可檢測FMR-1mRNA,了解基因的表達情況4/17/202424Wang等還利用CpG島兩側引物通過PCR方法擴增CpG島鄰近區(qū)域來判斷CpG島甲基化狀態(tài) 將基因組DNA先經甲基化敏感性酶充分酶切后再進行PCR擴增。正常男性CpG島未甲基化,模板DNA可被切割而檢測不到PCR產物,男性患者CpG島存在異常甲基化,故該位點不能被甲基化敏感性酶識別而擴增出一固定大小的PCR產物此法能診斷男性患者,適用于對FraX

男性患者的確診及群體篩查,但不能鑒別正常男性及正常男性傳遞者,且這類個體基因組DNA經上述酶切不完全時也可產生假陽性。為防止酶解不全造成假象,所有陽性標本均應用Souhern印跡雜交進一步驗證。因女性有一條X染色體本身就已存在甲基化,故不使用于女性標本的檢測4/17/202425轉錄水平的檢測

Pieretti

等研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)FraX男性患者有FMR-1mRNA表達,少數(shù)男性患者體內因CpG島不完全甲基化而有少量表達*

Feng

等還通過Northern印跡雜交、RT-PCR等在對正常及前突變等位基因的研究中發(fā)現(xiàn),二者在FMR-1mRNA轉錄過程、表達水平及穩(wěn)定性等方面極為相似,因而推測前突變攜帶者不表現(xiàn)臨床癥狀可能與mRNA轉錄水平正常密切相關**檢測mRNA水平有助于FraX患者的診斷及表型的預測*

Pieretti

M,ZhangFP,FuYH,etal.Cell,1991,66(4)**

FengY,LakkisL,DevysD,etal.AmJHumGenet,1995,56(1)4/17/202426蛋白水平的檢測

Willemsen等（1995）發(fā)明了一種單克隆抗體快速診斷方法，只需1～2滴血制成涂片，自然干燥，多聚甲醛固定，純甲醇處理，以磷酸鹽緩沖液洗滌，然后與鼠單克隆抗體孵育，以鏈親和素-生物素堿性磷酸酶系統(tǒng)顯色，24小時內即可出結果。**

WillemsenR,SmitsA,MohkamsingS,etal.HumGenet,1997,99(3)4/17/202427該法簡便、經濟、快速、相對無創(chuàng)傷。不僅可以診斷出由于(CGG)n的擴增導致的FraX患者,還可以檢測出由于缺失、點突變導致FMR-1基因不表達的患者,適用于群體篩查因女性患者體內有一定比例的活性X染色體,具有全突變的女性患者(尤其成年女性)其白細胞的正常染色體有優(yōu)先活躍的傾向,大多數(shù)淋巴細胞的FMRP降低不明顯,易形成假陰性,且由于前突變等位基因能正常轉錄,FMRP表達多在正常范圍內,因此僅適用于男性患者的診斷,不適合于前突