經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第1頁(yè)第一節(jié)沉淀反應(yīng)第二節(jié)凝集反應(yīng)第三節(jié)補(bǔ)體參加抗原 抗體反應(yīng)第四節(jié)中和反應(yīng)第五章 經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第2頁(yè)第一節(jié)沉淀反應(yīng)第二節(jié)凝集反應(yīng)第三節(jié)補(bǔ)體參加抗原 抗體反應(yīng)第四節(jié)中和反應(yīng)第五章 經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第3頁(yè)第一節(jié)沉淀反應(yīng)依據(jù)抗原與抗體反應(yīng)條件及附加原因，沉淀反應(yīng)可分為兩種主要形式：1．溶液中沉淀反應(yīng)

2．凝膠中沉淀反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第4頁(yè)第一節(jié)沉淀反應(yīng)依據(jù)抗原與抗體反應(yīng)條件及附加原因，沉淀反應(yīng)可分為兩種主要形式：

1．溶液中沉淀反應(yīng)

2．凝膠中沉淀反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第5頁(yè)1．溶液中沉淀反應(yīng)

（Precipitationreactioninsolution）

是指在清徹透明液體中，呈溶解狀態(tài)抗原與抗體在試管內(nèi)或凹玻片上混勻，可凝聚成為肉眼可見(jiàn)絮狀或顆粒狀不溶性沉淀物。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第6頁(yè)溶液中沉淀反應(yīng)

鹽溶液抗原+抗體———

沉淀

20~56℃、pH6～8

抗原：沉淀原抗體：沉淀素經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第7頁(yè)1．溶液中沉淀反應(yīng)

（Precipitationreactioninsolution）

（1）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)（2）免疫比濁法（3）免疫沉淀技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第8頁(yè)（1）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)

環(huán)狀沉淀試驗(yàn)

（ringprecipitationtest）或毛細(xì)管內(nèi)沉淀反應(yīng) （precipitationin capillarytube）經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第9頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第10頁(yè)（2）免疫比濁法(immunonephelomytry）

可溶性抗原、抗體在液相中特異結(jié)合，形成一定大小抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)渾濁。復(fù)合物量與濁度成正比。與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可計(jì)算出樣品中抗原或抗體含量。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第11頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第12頁(yè)免疫沉淀技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第13頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第14頁(yè)免疫共沉淀經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第15頁(yè)GSTpull-down技術(shù)

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第16頁(yè)第一節(jié)沉淀反應(yīng)依據(jù)抗原與抗體反應(yīng)條件及附加原因，沉淀反應(yīng)可分為兩種主要形式：1．溶液中沉淀反應(yīng)

2．凝膠中沉淀反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第17頁(yè)2．凝膠中沉淀反應(yīng)（Precipitationreactioningel）

1968年Ouchterlong創(chuàng)造。即將抗原抗體溶液放在瓊脂凝膠板上小孔中，使它們彼此對(duì)向擴(kuò)散，在抗原抗體相遇地方形成沉淀線。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第18頁(yè)2．凝膠中沉淀反應(yīng)

此沉淀線突出性質(zhì)是：特異性抗原抗體不能經(jīng)過(guò)；與沉淀線無(wú)關(guān)抗原和抗體分子則可自由經(jīng)過(guò)此沉淀線。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第19頁(yè)2．凝膠中沉淀反應(yīng)（1）單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（2）雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（3）免疫電泳（4）火箭電泳試驗(yàn)（5）免疫印跡技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第20頁(yè)單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第21頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第22頁(yè)雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第23頁(yè)（3）免疫電泳（immunoelectrophoresis）經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第24頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第25頁(yè)（4）火箭電泳試驗(yàn)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第26頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第27頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第28頁(yè)又稱Westernblotting電泳印漬及檢測(cè)（5）免疫印漬技術(shù)（immunoblotting）經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第29頁(yè)免疫印漬經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第30頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第31頁(yè)第一節(jié)沉淀反應(yīng)第二節(jié)凝集反應(yīng)第三節(jié)補(bǔ)體參加抗原 抗體反應(yīng)第四節(jié)中和反應(yīng)第五章 經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第32頁(yè)第二節(jié)凝集反應(yīng)1．直接凝集反應(yīng)2．間接凝集反應(yīng)3．橋梁凝集反應(yīng)4．共同凝集反應(yīng)

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第33頁(yè)第二節(jié)凝集反應(yīng)1．直接凝集反應(yīng)2．間接凝集反應(yīng)3．橋梁凝集反應(yīng)4．共同凝集反應(yīng)

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第34頁(yè)1．直接凝集反應(yīng)

（directagglutination）

是將細(xì)菌或紅細(xì)胞與其對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第35頁(yè)1．直接凝集反應(yīng)（1）微生物凝集反應(yīng) 如診療傷寒病肥達(dá)氏（Widalreaction）反應(yīng)（2）同種紅細(xì)胞凝集反應(yīng)如檢驗(yàn)血型血細(xì)胞凝集現(xiàn)象經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第36頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第37頁(yè)第二節(jié)凝集反應(yīng)1．直接凝集反應(yīng)2．間接凝集反應(yīng)3．橋梁凝集反應(yīng)4．共同凝集反應(yīng)

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第38頁(yè)2．間接凝集反應(yīng)

（indirectagglutination）

用可溶性抗原（或抗體）包被在一個(gè)與免疫無(wú)關(guān)、具一定大小不溶性顆粒（即載體顆粒，如：乳膠顆?；蚣t細(xì)胞）表面，然后與對(duì)應(yīng)抗體（或抗原）作用，在有適宜電解質(zhì)存在條件下，結(jié)合產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第39頁(yè)2．間接凝集反應(yīng)正向間接凝集反應(yīng)：將抗原先吸附在載體表面，然后與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生凝集反應(yīng)。反向間接凝集反應(yīng)：將特異性抗體先吸附在載體表面，然后與對(duì)應(yīng)抗原結(jié)合產(chǎn)生凝集反應(yīng)。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體；方法簡(jiǎn)便、敏感。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第40頁(yè)正向間接凝集反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第41頁(yè)

此方法對(duì)檢測(cè)微量抗原含有較高敏感性。而且因?yàn)橄嚓P(guān)病原體抗原成份普通情況下比血清抗體出現(xiàn)早，所以可用于一些傳染病如鉤端螺旋體抗原和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或原發(fā)性肝癌AFP檢測(cè)等。反向間接凝集反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第42頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第43頁(yè)第二節(jié)凝集反應(yīng)1．直接凝集反應(yīng)2．間接凝集反應(yīng)3．橋梁凝集反應(yīng)4．共同凝集反應(yīng)

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第44頁(yè)3．橋梁凝集反應(yīng)

又稱Coombs抗球蛋白試驗(yàn)。此試驗(yàn)用于檢測(cè)不完全抗體。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第45頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第46頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第47頁(yè)第二節(jié)凝集反應(yīng)1．直接凝集反應(yīng)2．間接凝集反應(yīng)3．橋梁凝集反應(yīng)4．共同凝集反應(yīng)

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第48頁(yè)4．共同凝集反應(yīng)

又稱協(xié)同凝集反應(yīng)。指由兩種顆粒成份相互作用而發(fā)生凝集反應(yīng)。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第49頁(yè)4．共同凝集反應(yīng)（1）細(xì)菌抗體與攜帶蛋白A金黃色葡萄球菌CowanⅠ系致敏，即經(jīng)過(guò)其IgGFc段與蛋白A結(jié)合，再與對(duì)應(yīng)細(xì)菌發(fā)生凝集反應(yīng)。（2）玫瑰花結(jié)試驗(yàn)：主要用于研究各種淋巴細(xì)胞特征。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第50頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第51頁(yè)E花環(huán)形成示意圖經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第52頁(yè)

B細(xì)胞EA、EAC玫瑰花環(huán)形成示意圖

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第53頁(yè)淋巴細(xì)胞分離經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第54頁(yè)玫瑰花結(jié)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第55頁(yè)淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞形成

玫瑰花結(jié)主要模式玫瑰花結(jié)類型紅細(xì)胞類型及處理淋巴細(xì)胞類型E花結(jié)綿羊紅細(xì)胞T、50%NKEA花結(jié)抗體致敏紅細(xì)胞B、T、NK、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞EAC花結(jié)補(bǔ)體致敏紅細(xì)胞B經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第56頁(yè)第一節(jié)沉淀反應(yīng)第二節(jié)凝集反應(yīng)第三節(jié)補(bǔ)體參加抗原 抗體反應(yīng)第四節(jié)中和反應(yīng)第五章 經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第57頁(yè)

第三節(jié)

補(bǔ)體參加抗原抗體反應(yīng)

1．補(bǔ)體參加直接抗原抗體反應(yīng)2．補(bǔ)體參加間接抗原抗體反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第58頁(yè)

第三節(jié)

補(bǔ)體參加抗原抗體反應(yīng)

1．補(bǔ)體參加直接抗原抗體反應(yīng)2．補(bǔ)體參加間接抗原抗體反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第59頁(yè)1．補(bǔ)體參加直接

抗原抗體反應(yīng)

（1）溶血反應(yīng)（2）溶菌反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第60頁(yè)（1）溶血反應(yīng)

（hemolyticassay）

溶血反應(yīng)常作為是否存在游離補(bǔ)體指示系統(tǒng)。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第61頁(yè)（1）溶血反應(yīng)1942年Rutstein和Walker依據(jù)補(bǔ)體能使兔抗羊紅細(xì)胞抗體致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血特點(diǎn)，建立了測(cè)定血清中總補(bǔ)體活性方法（即50%溶血反應(yīng)CH50

測(cè)定方法）經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第62頁(yè)（2）溶菌反應(yīng)

溶菌反應(yīng)常作為某血清中是否存在對(duì)應(yīng)抗體檢測(cè)方法。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第63頁(yè)

第三節(jié)

補(bǔ)體參加抗原抗體反應(yīng)

1．補(bǔ)體參加直接抗原抗體反應(yīng)2．補(bǔ)體參加間接抗原抗體反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第64頁(yè)2．補(bǔ)體參加間接

抗原抗體反應(yīng)

（1）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（2）被動(dòng)紅細(xì)胞溶解試驗(yàn)（3）溶血空斑試驗(yàn)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第65頁(yè)（1）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complementfixationtest）

1901年由Bordet和Gengou首先應(yīng)用溶血反應(yīng)作為指示系統(tǒng)，建立檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)方法。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第66頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第67頁(yè)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)原理經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第68頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第69頁(yè)（2）被動(dòng)紅細(xì)胞溶解試驗(yàn)

即吸附抗原紅細(xì)胞在有對(duì)應(yīng)抗體和補(bǔ)體存在時(shí)，出現(xiàn)紅細(xì)胞溶解反應(yīng)?？乖旅艏t細(xì)胞——加入待測(cè)血清和補(bǔ)體——判斷結(jié)果（陽(yáng)性對(duì)照：加入對(duì)應(yīng)抗體和補(bǔ)體）

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第70頁(yè)（3）溶血空斑試驗(yàn)

是測(cè)定B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和分泌抗體功效一個(gè)體外試驗(yàn)方法。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第71頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第72頁(yè)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第73頁(yè)溶血空斑試驗(yàn)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第74頁(yè)第一節(jié)沉淀反應(yīng)第二節(jié)凝集反應(yīng)第三節(jié)補(bǔ)體參加抗原 抗體反應(yīng)第四節(jié)中和反應(yīng)第五章 經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第75頁(yè)第四節(jié)中和反應(yīng)中和反應(yīng)（neutralization）：是免疫學(xué)和病毒學(xué)中常見(jiàn)于檢測(cè)中和抗體是否存在及其效價(jià)試驗(yàn)，反應(yīng)抗體中和病毒感染性或細(xì)菌毒素生物學(xué)效應(yīng)。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第76頁(yè)

中和抗體：病原微生物侵入機(jī)體后，使之產(chǎn)生能中和對(duì)應(yīng)微生物及其毒性產(chǎn)物（毒素），從而使病原微生物喪失感染能力或毒力抗體。（中和抗體：能與病毒結(jié)合，使其失去感染力抗體?？苟舅兀耗芘c細(xì)菌外毒素結(jié)合，中和其毒性作用抗體。）經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第77頁(yè)中和反應(yīng)原理

即將被檢血清與病原微生物混合，經(jīng)適當(dāng)初間作用后，接種于宿主系統(tǒng)（包含動(dòng)物、雞胚或培養(yǎng)細(xì)胞），按照對(duì)其產(chǎn)生保護(hù)效果差異，可判斷該微生物或毒素是否已被中和，并計(jì)算出中和程度（中和指數(shù)），即代表中和抗體效價(jià)。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第78頁(yè)中和反應(yīng)特點(diǎn)：

（1）檢測(cè)機(jī)體內(nèi)是否存在中和抗體以及中和抗體效價(jià)，直接反應(yīng)機(jī)體抗病毒能力，有利于臨床診療；（2）中和抗體在體內(nèi)存留時(shí)間普通較長(zhǎng)，可用于流行病學(xué)調(diào)查；（3）中和反應(yīng)有嚴(yán)格種、型特異性，可對(duì)分離病毒進(jìn)行準(zhǔn)確分類判定。缺點(diǎn)：操作麻煩，試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)。經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第79頁(yè)中和反應(yīng)類型：1．終點(diǎn)法中和反應(yīng)2．蝕斑降低法中和反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第80頁(yè)1．終點(diǎn)法中和反應(yīng)

依據(jù)滴定被血清中和后殘余毒力，來(lái)判斷血清中中和抗體效價(jià)。（1）固定病毒稀釋血清法（2）固定血清稀釋病毒法

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第81頁(yè)（1）固定病毒稀釋血清法

先固定病毒毒價(jià)，再與等量遞進(jìn)稀釋待測(cè)血清混合，置37℃1小時(shí)，每一稀釋度接種3～6只動(dòng)物（或雞胚、培養(yǎng)細(xì)胞），接種后統(tǒng)計(jì)每組動(dòng)物（或雞胚）存活數(shù)和死亡數(shù)（或培養(yǎng)細(xì)胞破壞程度），然后計(jì)算其半數(shù)保護(hù)率（PD50），即該血清中和效價(jià)。

經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第82頁(yè)（2）固定血清稀釋病毒法

將病毒原液作10倍遞進(jìn)稀釋，分別與等量正常血清（對(duì)照組）、待測(cè)血清（試驗(yàn)組）混合，置37℃1小時(shí)，每一稀釋度接種3～6只動(dòng)物（或雞胚、培養(yǎng)細(xì)胞），接種后統(tǒng)計(jì)每組動(dòng)