動物組織和細胞培養(yǎng)

關(guān)于動物組織和細胞培養(yǎng)一動物細胞培養(yǎng)的基本條件無菌條件：凈化工作室，風淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，高壓滅菌器，抗生素細胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，

CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標儀，微孔板震蕩器，高速離心機，移液器細胞保存條件：液氮罐實驗室安全：生物實驗室安全，P1,P2,P3實驗室安全第一節(jié)細胞培養(yǎng)的基礎知識第2頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(一)無菌條件凈化工作室，風淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，高壓滅菌器，抗生素.第3頁,共48頁，2024年2月25日，星期天1凈化工作室

------我國藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標準-------潔凈度級別塵粒最大允許數(shù)/立方米塵粒最大允許數(shù)

≥0.5um

≥5um浮游菌/立方沉降菌/皿

100

3,500

0

5

1

10,000

350,000

2,000

100

3

100,000

3,500,000

20,000

500

10

300,000

10,500,000

60,000

NA

15第4頁,共48頁，2024年2月25日，星期天●風淋室是生物潔凈室的理想配套設備，用于吹除進入潔凈廠房的人、物表面附著的塵?！袷沁M行人身、物料凈化和防止室外空氣侵入潔凈區(qū)的有效設備●風淋室可以配合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調(diào)，一般控制溫度在30-35℃較為適宜。

2風淋室:

第5頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

該裝置是一種潔凈室的輔助設備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。

3傳遞窗:

第6頁,共48頁，2024年2月25日，星期天●高效過濾器是用超細玻璃纖維紙作濾料，膠板紙作分隔板，可與鋁合金框、木框及鍍鋅鋼板框組合而成。

●特點：具有低阻高效、輕質(zhì)、容塵量大等特點，●適用于常溫常壓常濕條件下環(huán)境空氣的凈化.4高效過濾器:第7頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

層流罩是可提供局部高潔凈環(huán)境的空氣凈化設備。潔凈層流罩是將空氣經(jīng)風機以一定的風壓通過高效空氣過濾器后，使?jié)崈艨諝獬蚀怪睔饬魉腿牍ぷ鲄^(qū)，從而保證了工作區(qū)內(nèi)達到工藝所需的高潔凈度。5潔凈層流罩:第8頁,共48頁，2024年2月25日，星期天6超凈工作臺

超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

第9頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

一種既能使操作造成無菌、無塵的局部空氣環(huán)境，保證檢驗、檢測不受污染，又能保證被研究的對象（如病菌、細菌等）不外溢，保護周圍環(huán)境及操作人員的安全隔離設備。

該設備可廣泛應用于低、中等危險度的臨床細菌學，病毒學、微生物學、組織培養(yǎng)、生物學及生命科學的研究，加工、檢驗部門。

7生物安全柜:

第10頁,共48頁，2024年2月25日，星期天8紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。

9電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒。10蔡氏（Zeiss）濾器：過濾除菌，濾器中的濾膜一般用0.2～0.3μm孔徑的微孔濾膜。凡在高溫或射線下易發(fā)生變性或失去功能的物質(zhì)，如人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等都須用濾器過濾除菌。第11頁,共48頁，2024年2月25日，星期天濾器大容量高壓滅菌器第12頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(二)細胞生長條件純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清第13頁,共48頁，2024年2月25日，星期天1自動雙重純水蒸餾器2純水儀反滲透

精濾、活性碳吸附

第14頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3標準型細胞培養(yǎng)板（TissueCulturePlates）

6孔，12孔，24孔，48孔，96孔

第15頁,共48頁，2024年2月25日，星期天4培養(yǎng)瓶第16頁,共48頁，2024年2月25日，星期天5CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱主要由箱體結(jié)構(gòu)件、溫度控制系統(tǒng)和CO2濃度控制系統(tǒng)三部分組成。CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2

。再現(xiàn)活體環(huán)境對于溫度、PH值CO2濃度、氧分壓（O2濃度）、相對濕度等細胞生長關(guān)鍵的因素，

第17頁,共48頁，2024年2月25日，星期天6移液器第18頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(三)細胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標儀，微孔板震蕩器，高速離心機，移液器第19頁,共48頁，2024年2月25日，星期天15用于微生物、細胞、細菌、組織培養(yǎng)、懸浮體、沉淀物等的觀察，并可將此過程中的任一形態(tài)拍攝下來。第20頁,共48頁，2024年2月25日，星期天酶標儀微孔板震蕩器23通過自動酶標儀計數(shù)來檢測活細胞數(shù)量。主要用于酶標板、細胞培養(yǎng)板(如6孔板、12孔板、24孔板、48孔、96孔板等)等溶液的混勻或細胞的混勻。

第21頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(四)細胞保存條件：液氮罐-196℃

第22頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(五)實驗室安全：生物實驗室安全，P1,P2,P3實驗室安全第23頁,共48頁，2024年2月25日，星期天實驗室安全層流凈化細胞培養(yǎng)室管理規(guī)則一級生物安全防護實驗室二級生物安全防護實驗室三級生物安全防護實驗室四級生物安全防護實驗室第24頁,共48頁，2024年2月25日，星期天層流凈化細胞培養(yǎng)室的總體要求：經(jīng)濟、有序、高效、安全。初步制定相關(guān)制度如下：局部小環(huán)境空氣達到潔凈度等級

層流凈化細胞培養(yǎng)室管理規(guī)則

第25頁,共48頁，2024年2月25日，星期天一級生物安全防護實驗室

實驗室結(jié)構(gòu)和設施、安全操作規(guī)程、安全設備適用于對健康成年人已知無致病作用的微生物，如用于教學的普通微生物實驗室等。實驗室安全級別第26頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二級生物安全防護實驗室

實驗室結(jié)構(gòu)和設施、安全操作規(guī)程、安全設備適用于對人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物。第27頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二級生物安全防護實驗室

1可能產(chǎn)生致病微生物氣溶膠或出現(xiàn)濺出的操作均應在生物安全柜(Ⅱ級生物安全柜為宜)或其他物理抑制設備中進行，并使用個體防護設備。

2處理高濃度或大容量感染性材料均必須在生物安全柜(Ⅱ級生物安全柜為宜)或其他物理抑制設備中進行，并使用個體防護設備。

上述材料的離心操作如果使用密封的離心機轉(zhuǎn)子或安全離心杯，且它們只在生物安全柜中開閉和裝載感染性材料，則可在實驗室中進行。

3當微生物的操作不可能在生物安全柜內(nèi)進行而必須采取外部操作時，為防止感染性材料濺出或霧化危害，必須使用面部保護裝置(護目鏡、面罩、個體呼吸保護用品或其他防濺出保護設備)。

4在實驗室中應穿著工作服或罩衫等防護服。離開實驗室時，防護服必須脫下并留在實驗室內(nèi)。不得穿著外出，更不能攜帶回家。用過的工作服應先在實驗室中消毒，然后統(tǒng)一洗滌或丟棄。

5當手可能接觸感染材料、污染的表面或設備時應戴手套。如可能發(fā)生感染性材料的溢出或濺出，宜戴兩副手套。不得戴著手套離開實驗室。工作完全結(jié)束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。第28頁,共48頁，2024年2月25日，星期天三級生物安全防護實驗室

實驗室結(jié)構(gòu)和設施、安全操作規(guī)程、安全設備適用于主要通過呼吸途徑使人傳染上嚴重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有預防傳染的疫苗。

例如：艾滋病病毒的研究(血清學實驗除外)應在三級生物安全防護實驗室中進行。例如：重癥SARS病人傳染性較強，這與病人產(chǎn)生的大量呼吸道飛沫有關(guān)。

第29頁,共48頁，2024年2月25日，星期天三級生物安全防護實驗室

1實驗室中必須安裝Ⅱ級或Ⅱ級以上生物安全柜。

2所有涉及感染性材料的操作應在生物安全柜中進行。當這類操作不得不在生物安全柜外進行時，必須采用個體防護與使用物理抑制設備的綜合防護措施。

3在進行感染性組織培養(yǎng)、有可能產(chǎn)生感染性氣溶膠的操作時，必須使用個體防護設備。

4當不能安全有效地將氣溶膠限定在一定范圍內(nèi)時，應使用呼吸保護裝置。

5工作人員在進入實驗室工作區(qū)前，應在專用的更衣室(或緩沖間)穿著背開式工作服或其他防護服。工作完畢必須脫下工作服，不得穿工作服離開實驗室?？稍俅问褂玫墓ぷ鞣仨毾认竞笄逑?。

6工作時必須戴手套(兩副為宜)。一次性手套必須先消毒后丟棄。

7在實驗室中必須配備有效的消毒劑、眼部清洗劑或生理鹽水，且易于取用?？膳鋫鋺彼幤?。第30頁,共48頁，2024年2月25日，星期天四級生物安全防護實驗室

實驗室結(jié)構(gòu)和設施、安全操作規(guī)程、安全設備適用于對人體具有高度的危險性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。與上述情況類似的不明微生物，也必須在四級生物安全防護實驗室中進行。待有充分數(shù)據(jù)后再決定此種微生物或毒素應在四級還是在較低級別的實驗室中處理。

第31頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

1在實驗室中所有感染性材料的操作都必須在Ⅲ級生物安全柜中進行。如果工作人員穿著整體的由生命維持系統(tǒng)供氣的正壓工作服，則相關(guān)操作可在Ⅱ級生物安全柜中進行。

2所有工作人員進入實驗室時都必須換上全套實驗室服裝，包括內(nèi)衣、內(nèi)褲、襯衣或連衫褲、鞋和手套等。所有這些實驗室保護服在淋浴和離開實驗室前均必須在更衣室內(nèi)脫下。

第32頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(六)培養(yǎng)細胞生長的條件1細胞的營養(yǎng)需要2細胞的生存環(huán)境溫度:37℃，O2CO2:5%，CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.43無污染4無毒第33頁,共48頁，2024年2月25日，星期天1細胞培養(yǎng)用液的配制1）水：新鮮配置的三蒸水或去離子水2）平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液，維持一定滲透壓和pH

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml第34頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3）消化液：

胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制,常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。第35頁,共48頁，2024年2月25日，星期天4）培養(yǎng)基：培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。①天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染第36頁,共48頁，2024年2月25日，星期天②合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。

合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低。缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。第37頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：

①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；

②多種金屬離子；

③激素；

④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；

⑤各種生長因子；

⑥轉(zhuǎn)移蛋白；

⑦不明成分。第41頁,共48頁，2024年2月25日，星期天一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死，但支持細胞生長一般需加10％血清．血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學特性是細胞和復雜血清因子的綜合反應。第42頁,共48頁，2024年2月25日，星期天③無血清培養(yǎng)基:在基礎培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。無血清