多位點序列分型

關(guān)于多位點序列分型Contents兩種分型方法的比較

MLST的步驟MLST的方案設(shè)計MLST的由來實例分析第2頁,共31頁，2024年2月25日，星期天多位點酶電泳（Multilocusenzymeelectrophoresis,MLEE）根據(jù)酶的電泳遷移率的不同來描述變異

選定管家酶

淀粉膠檢測

不同電泳遷移速率電泳譜等位基因的變異性揭示微生物基因多樣性第3頁,共31頁，2024年2月25日，星期天MLEE的缺點不能推斷特殊位點的堿基序列不同實驗室間的分型結(jié)果不能進(jìn)行比較第4頁,共31頁，2024年2月25日，星期天MLST的首次使用MLST是由多位點酶電泳(MLEE)衍生出來的一種分型方法在1998年,Maiden等首次將MLST應(yīng)用于腦膜炎奈瑟菌分型第5頁,共31頁，2024年2月25日，星期天多位點序列分型（MLST）一種基于核酸序列測定的細(xì)菌分型方法通過PCR擴增多個管家基因內(nèi)部片段測定其序列，分析菌株的變異第6頁,共31頁，2024年2月25日，星期天MLST的原理MLST方法一般測定6~10個管家基因內(nèi)部400~600bp的核苷酸序列，每個位點的序列根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時間順序賦予一個等位基因編號，每一株菌的等位基因編號按照指定的順序排列就是它的等位基因譜，也即是這株菌的序列型（sequencetype,ST）。這樣得到的每個ST均代表一組單獨的核苷酸序列信息。第7頁,共31頁，2024年2月25日，星期天序列型（ST）序列型（Sequence-typying,STs）等同于MLEE得出的電泳型(Electrophoretictype,ET）通過比較ST可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性,即密切相關(guān)菌株具有相同的ST或僅有極個別基因位點不同的ST,而不相關(guān)菌株的ST至少有3個或3個以上基因位點不同第8頁,共31頁，2024年2月25日，星期天MLST分析方法MLST技術(shù)針對看家基因設(shè)計引物對其進(jìn)行PCR擴增和測序,得出每個菌株各個位點的等位基因數(shù)值,然后進(jìn)行等位基因圖譜(allelicprofile)或序列類型(sequencetypes,STs)鑒定，再根據(jù)等位基因圖譜使用配對差異矩陣(matrixpair-wisedifferences)等方法構(gòu)建系統(tǒng)樹圖進(jìn)行聚類分析。第9頁,共31頁，2024年2月25日，星期天MLST方案的設(shè)計三要素：選擇經(jīng)過初步篩選的菌株選擇具有獨特特征的基因位點設(shè)計用于基因擴增和序列測定的引物第10頁,共31頁，2024年2月25日，星期天1.菌株的選擇根據(jù)已有的分型方法和流行病學(xué)資料，選擇100株左右具有代表性的菌株作為分析對象。理論上，這些選定的菌株要代表所研究細(xì)菌的群體，而不是僅僅包含那些對人致病的克隆。收集的菌株最好具有代表性，不僅僅由一個亞型組成。第11頁,共31頁，2024年2月25日，星期天2.管家基因的確定全基因組序列的測定大大方便MLST位點的選擇一般選擇10到20株菌評價10至15個備選位點。最終采用7個位點進(jìn)行后續(xù)實驗和分析。如果需要提高分辨力，可以加入個別非保守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基因，這樣比增加管家基因的個數(shù)將更有效第12頁,共31頁，2024年2月25日，星期天3.引物的設(shè)計目的片段長度：400~600bp所有引物調(diào)整為同一退火溫度，以適用于大范圍流行病學(xué)監(jiān)測和群體研究為了發(fā)現(xiàn)引物結(jié)合位點可能存在的變異，每個位點都應(yīng)該設(shè)計一對以上引物第13頁,共31頁，2024年2月25日，星期天/實際運用中，對于已有的成熟MLST方案的細(xì)菌，可直接從MLST數(shù)據(jù)庫中獲取方案。/第14頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共31頁，2024年2月25日，星期天MLST的步驟（二）

——核酸序列信息的獲取收集病原微生物標(biāo)本基因組DNA的獲取PCR擴增目的基因片段目的片段的核酸序列測定整合核酸序列信息第18頁,共31頁，2024年2月25日，星期天MLST的步驟（三）——結(jié)果分析第19頁,共31頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果分析根據(jù)分析的細(xì)菌群體組成1.以等位基因編號和ST編號為基本分析單位

提交到MLST分析網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（www.mlst.net）

START和eBURST2.直接分析核苷酸序列

上傳到GenBank比對服務(wù)器進(jìn)行BLAST比對驗證第20頁,共31頁，2024年2月25日，星期天數(shù)據(jù)分析得到等位基因圖譜新的STs則找出對應(yīng)的clonalcomplex在數(shù)據(jù)庫中找出相應(yīng)的STs群體進(jìn)化研究分子流行病學(xué)研究菌群結(jié)構(gòu)調(diào)查菌群遺傳學(xué)分析疾病的全球性監(jiān)控鑒定暴發(fā)性疾病的病原體MLST結(jié)果分析流程圖第21頁,共31頁，2024年2月25日，星期天ST和克隆型遺傳學(xué)上具有相關(guān)性但并不相同的細(xì)菌的集合,被稱為是同源復(fù)合體(Theclonalcomplex),也叫克隆型。以其核心的基因型來命名。第22頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

MLST和PFGE的比較

——兩種不同的分子分型技術(shù)第23頁,共31頁，2024年2月25日，星期天不同分子分型方法比較分型方法分型力可分辨率可重復(fù)性結(jié)果易解釋性易操作性費用RAPD較好較高一般一般簡便低PCR-RFLP好一般一般一般簡便低AFLP較好高一般好簡便中MLST較好較高好好簡便較高PFGE好高好好復(fù)雜較高M(jìn)LVA很好高好好簡便高第24頁,共31頁，2024年2月25日，星期天MLST和PFGE的比較

——兩種不同的分子分型技術(shù)脈沖場凝膠電泳（PFGE）比較所確定的高度變異片段高分辨力不適于進(jìn)行全面的流行病學(xué)調(diào)查及生物進(jìn)化分析不同實驗間重復(fù)性較差標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)數(shù)據(jù)庫多位點序列分型（MLST）比較進(jìn)化較慢的位點標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)數(shù)據(jù)庫不同實驗室間重復(fù)性好不適用于同血清型菌株間比較第25頁,共31頁，2024年2月25日，星期天MLST實例分析第26頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

1.MLST方案（同MLSTDatabase）

第27頁,共31頁，2024年2月25日，星期天2.核酸序列信息的獲取2.1樣本來源54株結(jié)腸彎曲菌(C.coli)分離于2002年零售禽肉中，均為不重復(fù)菌株2.2PCR擴增2.3測序第28頁,共31頁，2024年2月25日，星期天3.結(jié)果分析3.1.MLST數(shù)據(jù)提交將測序序列在線遞交至彎曲菌MLS