微生物限度檢查

關(guān)于微生物限度檢查12第一節(jié)微生物限度檢查概述及限度標準一、微生物限度檢查的概念和意義

1、微生物限度檢查的概念微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。第2頁,共81頁，2024年2月25日，星期天32、微生物限度檢查的意義（1）藥品染菌對使用者的潛在危害藥品中染菌數(shù)量愈高，其中所含致病菌的幾率愈高，這是造成藥源性感染疾病的直接原因。藥品染菌還可使其產(chǎn)生霉變、酸敗等理化性質(zhì)改變造成藥品失效、變質(zhì)，甚至產(chǎn)生毒素，危害使用者的健康。為保證藥品質(zhì)量，必須對微生物污染進行必要的控制和檢驗。第3頁,共81頁，2024年2月25日，星期天4（2）藥品染菌反映藥品生產(chǎn)工藝的科學(xué)性、合理性及質(zhì)量管理水平。微生物限度檢查的各項數(shù)據(jù)，是對藥品生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)環(huán)境、質(zhì)量管理及人員素質(zhì)的綜合評價依據(jù)之一。只有優(yōu)良的GMP企業(yè)，才能提供優(yōu)質(zhì)的醫(yī)藥產(chǎn)品，凡工藝條件、生產(chǎn)管理水平、生產(chǎn)人員素質(zhì)差，不注意文明生產(chǎn)的單位和企業(yè)，其生產(chǎn)的藥品，染菌必然嚴重，不合格率高。第4頁,共81頁，2024年2月25日，星期天5二、藥品微生物限度檢查的特殊性和基本條件

1、藥品微生物限度檢查的特殊性（1）活體細胞（2）分布不勻（3）多數(shù)處于受損狀態(tài)（4）生境復(fù)雜第5頁,共81頁，2024年2月25日，星期天6（1）活體細胞

藥品微生物限度檢查以活體菌細胞為對象，污染菌在藥品中處于不穩(wěn)定狀態(tài)，可隨存放時間延長而死亡，也可在適宜條件下大量繁殖。藥品還可因為本身性質(zhì)，存放溫、濕度，暴露空氣等狀態(tài)不一，污染菌發(fā)生變化導(dǎo)致檢出結(jié)果的差異.

由于檢驗對象的這種活體特征，保持供檢樣品污染菌尚存活而又不大量增殖尤為重要。第6頁,共81頁，2024年2月25日，星期天7（2）分布不勻

藥品中微生物特別是在生產(chǎn)企業(yè)后期污染者通常是局部的，非均勻的，同一批產(chǎn)品中不同部位、人員操作、包裝點的不同瓶（盒、袋）常出現(xiàn)檢測結(jié)果差異。為提高檢出的陽性率，限度檢驗的供檢樣品規(guī)定了檢驗數(shù)量。第7頁,共81頁，2024年2月25日，星期天8（3）多數(shù)處于受損狀態(tài)

藥品污染菌自生長過程中受到原料處理、加工、加熱以及藥物本身的影響，有一定的損傷，受損的細胞在常規(guī)的直接培養(yǎng)中，往往不能及時復(fù)蘇，進入繁殖周期，所得檢驗結(jié)果常是“陰性”或計數(shù)偏低而“符合規(guī)定”的結(jié)論。因此，在檢驗時須采用一些措施，利于被檢菌的恢復(fù)從而提高陽性檢出率。第8頁,共81頁，2024年2月25日，星期天9

（4）生境復(fù)雜

由于藥品的種類繁多，劑型多樣，使染菌的生境多樣而復(fù)雜，在某些藥品中大量繁殖，而在另一些藥品中不能生長。藥物的pH、滲透壓、含水量以及污染菌的檢查常會出現(xiàn)不同的結(jié)果，如一些非水溶性油劑、軟膏劑，由于其疏水性致使菌細胞與培養(yǎng)基成分隔離或因缺氧而難以生長。第9頁,共81頁，2024年2月25日，星期天10

2、藥品微生物限度檢查的基本條件由于污染菌在藥品中的不穩(wěn)定性和諸多影響因素，為真實地反映藥品的污染狀況，除采用準確可靠的方法和對檢驗結(jié)果的正確判斷外，尤須注意以下幾項基本條件：第10頁,共81頁，2024年2月25日，星期天11

1）使用符合規(guī)定的培養(yǎng)基

使用符合規(guī)定的培養(yǎng)基是限度檢查的最基礎(chǔ)保障。而培養(yǎng)基的適用性檢查尤為重要，2010版藥典明確規(guī)定，實驗用培養(yǎng)基必須經(jīng)過適用性檢查，結(jié)果符合規(guī)定方可使用。第11頁,共81頁，2024年2月25日，星期天12

2）保持供檢樣品的原污染狀態(tài)

對供檢樣品提供原始污染狀況的微生物檢查數(shù)據(jù)是限度檢查的基本任務(wù)。藥品的第二次污染及繁殖或死亡引起的狀態(tài)改變均不能反應(yīng)藥品的微生物真實質(zhì)量。第12頁,共81頁，2024年2月25日，星期天13

3）按規(guī)定抽樣檢驗

由于藥品染菌的隨機性和不均勻性，欲從小量抽樣檢驗反映整批藥品的染菌狀況是不可能的。由于微生物限度檢查是破壞性檢查，檢驗一瓶破壞一瓶，增加抽驗量及檢驗數(shù)量對提高檢出率無疑是有利的，但抽量過多，生產(chǎn)、經(jīng)營單位難以承受。因此藥典規(guī)定了檢驗量和數(shù)量。第13頁,共81頁，2024年2月25日，星期天14

4）適宜的供試液制備方法正確制備供試液是保證檢查結(jié)果可靠的前提條件，供試液制備的基本要求是，供試品必須均勻分散于供試液中，被檢菌應(yīng)受到必要的保護。第14頁,共81頁，2024年2月25日，星期天15

5）驗證實驗及對照實驗

驗證的目的主要是考察供檢驗品中有無抑菌活性物質(zhì)干擾實驗、檢驗方法和培養(yǎng)條件的可行性。若在確立新藥檢驗方法及當檢驗條件變更時，如藥品的組分、供試液制備方法或培養(yǎng)基變更等可能影響檢驗結(jié)果時，須重新做驗證實驗。對一些已確立檢驗方法的品種，采用可行的供試液制備方法和固定的培養(yǎng)基，在進行常規(guī)法時可免去驗證實驗的繁瑣步驟，制作一些必要的對照實驗。通常的對照實驗有二種，一種是陰性對照，另一種是陽性對照。第15頁,共81頁，2024年2月25日，星期天16

6）嚴格無菌環(huán)境及操作

實驗操作應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級和局部潔凈100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行。進行限度檢查時，操作人員的無菌觀念應(yīng)貫穿全過程，即在檢查過程中的每一空間、每一動作、任一器具未經(jīng)滅菌處理都是帶菌的，供檢樣品或接種物與之接觸都會造成污染，即使在潔凈室內(nèi)操作，仍須嚴格按照無菌程序操作，避免操作不當?shù)奈廴驹斐蓹z驗結(jié)果錯誤。第16頁,共81頁，2024年2月25日，星期天17三、微生物檢查的內(nèi)容和檢驗方法

制定不同藥品微生物限度標準須按其使用要求、制劑類型、原料性質(zhì)以及生產(chǎn)條件等綜合考慮，對各種繁多的藥品，各國藥典均規(guī)定了相應(yīng)的微生物限度標準，這些標準的要求基本相同，但不一致。我國藥典，根據(jù)藥品使用的要求，可將微生物限度標準分為兩大類：第17頁,共81頁，2024年2月25日，星期天18對于規(guī)定滅菌的藥品，包括注射劑和輸液劑，以及用于體腔、嚴重?zé)齻?、潰瘍、出血及眼科用藥等制劑。必須嚴格無菌，即在規(guī)定檢驗量的供檢樣品中不得檢出活微生物。對于非規(guī)定滅菌藥品，包括常用的口服制劑與局部外用制劑。對這一部分制劑一般不要求絕對無菌，允許在規(guī)定量的樣品中，檢出一定限量的微生物，但不得檢出某些控制菌。通常藥品微生物限度檢查的檢驗對象多為此類藥物。此外，與藥品質(zhì)量密切相關(guān)的還有輔料、包裝材料以及生產(chǎn)環(huán)境的檢測和醫(yī)用材料、器械等也都制定了相應(yīng)的微生物學(xué)限度指標。第18頁,共81頁，2024年2月25日，星期天19

微生物限度檢查的內(nèi)容和檢驗方法包括：（1）染菌量檢查：測定單位重量（體積或面積）藥品中的細菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)。制備適宜方法的供試液后，可以采用下列三種方式進行檢驗：①平皿法系列稀釋供試液，分別加入滅菌平皿中，然后傾注瓊脂。②涂布法將系列稀釋的供試液分別涂布于已事先備妥的瓊脂平板上③薄膜過濾法將供試液用薄膜過濾，取出濾膜貼于瓊脂平板或其它培養(yǎng)基中。第19頁,共81頁，2024年2月25日，星期天20（2）控制菌檢查：測定單位重量（體積或面積）藥品中的糞便污染指示菌和某些特定菌，如大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌、白色念珠菌、螨等在規(guī)定量的樣品中不得檢出或不超過某限度。對于大腸菌群，采用系列稀釋級供試液，分別定量加置規(guī)定數(shù)量的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄出現(xiàn)產(chǎn)酸或產(chǎn)氣的管數(shù)，按最近似數(shù)（MPN）對染菌量做出定量估計。第20頁,共81頁，2024年2月25日，星期天21

對于其它控制菌，通常是將制備好的供試液，按照待檢菌的特性取規(guī)定量直接接種于培養(yǎng)基或經(jīng)薄膜過濾法處理后接種于培養(yǎng)基，分別進行增菌、分離培養(yǎng)，在獲得單個疑似菌株培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上作形態(tài)學(xué)、生化及血清學(xué)鑒定。第21頁,共81頁，2024年2月25日，星期天22四、檢驗結(jié)果報告及復(fù)試

1.細菌、霉菌及酵母菌數(shù)報告及復(fù)試細菌、霉菌及酵母菌數(shù)，一般以每1g、lml或l0cm2菌落形成單位數(shù)（colonyformingnints,cfu）報告，特殊藥品可以最小包裝單位報告。第22頁,共81頁，2024年2月25日，星期天23

供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)檢查中，任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，應(yīng)進行復(fù)試。我國藥典規(guī)定，對菌落數(shù)測定當一次檢查不合格時，應(yīng)從同一批樣品中隨機抽樣，獨立復(fù)試兩次，以三次檢查結(jié)果的平均值報告菌數(shù)，這是對染菌處在合格邊緣數(shù)的產(chǎn)品，避免由此引起可能的爭議采取的一種界定方法。第23頁,共81頁，2024年2月25日，星期天242.控制菌報告及復(fù)試

大腸菌群的最近似數(shù)MPN值（Mostprobablenumber），它是通過概率計算的近似值也并非精確數(shù)量，一般以每1g或1ml應(yīng)小于多少個報告?？刂凭绱竽c埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌及梭菌的檢查結(jié)果以每1g、lml或l0cm2為單位報告，沙門氏菌是以10g或10ml為單位報告。特殊藥品可以最小包裝單位報告。供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準，不再復(fù)試。第24頁,共81頁，2024年2月25日，星期天253.微生物限度檢查報告若供試品的細菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)、控制菌三項檢驗結(jié)果均符合該品種項下的規(guī)定，判供試品在該實驗條件下符合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品在該實驗條件下不符合規(guī)定。第25頁,共81頁，2024年2月25日，星期天26五、微生物檢查流程舉例

不同給藥途徑的供試品，標準要求不一樣，因而需要檢查的項目也有所不同，整個試驗流程就不同。下面我們以化藥直腸給藥的栓劑為例。整個實驗流程如圖6-1所示。第26頁,共81頁，2024年2月25日，星期天27（1）查標準根據(jù)樣品給藥途徑，確定檢查項目，方法和所用的實驗用具和培養(yǎng)基；（2）培養(yǎng)基配制、樣品的前處置、實驗用具的前處置；（3）供試品的制備；（4）檢查各項目：細菌霉菌及酵母菌計數(shù)、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢查、白色念珠菌檢查；（5）將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌檢查用培養(yǎng)基分別劃線于相應(yīng)的選擇性平板上；第27頁,共81頁，2024年2月25日，星期天28（6）觀察上述劃線平板上的菌落是否為疑似菌，如果無菌生長或無疑似菌報告未檢出，如果有疑似菌則要經(jīng)過下一步的確證實驗，經(jīng)實驗確認的控制菌，則報告檢出；（7）細菌霉菌及酵母菌，按照菌落報告規(guī)則計數(shù)，如果菌落數(shù)小于標準規(guī)定數(shù)，則直接計數(shù)即可；如果計數(shù)結(jié)果超過了標準規(guī)定數(shù)，則須進行復(fù)試；（8）寫實驗報告。第28頁,共81頁，2024年2月25日，星期天29第二節(jié)前處置及供試液的制備一、檢驗樣品前處置

樣品包裝的完整性和樣品的有效性關(guān)系到檢測結(jié)果的準確性。完整性要求檢測樣品的最小包裝原始、完好，沒有任何破損。有效性要求檢測樣品編號的唯一性和可追溯性，以及樣品內(nèi)在的微生物能保持其原始數(shù)量和原始種類。第29頁,共81頁，2024年2月25日，星期天301、樣品的接收 檢查樣品的完整性，核對品名、規(guī)格、批號、有效期、生產(chǎn)單位等信息；加貼樣品狀態(tài)標識（待檢、在檢、檢畢、留樣），并逐一登記。第30頁,共81頁，2024年2月25日，星期天31

2、樣品的儲存和保管

(1)應(yīng)有適宜的樣品儲存場所存放樣品。要根據(jù)樣品的儲存要求進行存放，一般宜儲存于陰涼干燥處，需要冷藏的樣品應(yīng)置冰箱冷藏室保存，并嚴格監(jiān)控、記錄存放環(huán)境的溫濕度。

(2)樣品在傳遞、檢驗過程中應(yīng)妥善保管，在檢樣品避免損壞、丟失和存放不當，影響檢驗結(jié)果的準確性。

第31頁,共81頁，2024年2月25日，星期天323、樣品檢驗前的處理

(1)去掉樣品的外包裝，注意唯一性標識要轉(zhuǎn)貼到最小包裝上，防止實驗時混淆。

(2)樣品進入無菌室前，應(yīng)用適宜的消毒液對其外表進行擦拭消毒處理，并經(jīng)紫外線照射30分鐘后進入操作間。第32頁,共81頁，2024年2月25日，星期天33

二、儀器及用具的處置儀器、用具使用前，應(yīng)洗滌干凈，吸管、量筒、試管、培養(yǎng)皿等玻璃制品不掛水滴，無殘留抗菌物質(zhì)，并經(jīng)無菌化處理。

(1)干熱滅菌物品：勻漿杯、剪刀、鑷子、不銹鋼藥勺、吸管、量筒、試管、培養(yǎng)皿、研缽等金屬、玻璃、陶瓷制品均可在干燥內(nèi)箱內(nèi)干熱滅菌。通常加熱至160℃恒溫2小時可完全滅菌。第33頁,共81頁，2024年2月25日，星期天34(2)高壓蒸汽滅菌物品：為最可靠、最廣泛使用的滅菌方法之一。凡是耐高溫和潮濕的物品如培養(yǎng)基、無菌衣、金屬、玻璃器材、陶瓷制品、傳染性污物等可用本法滅菌。將需要滅菌的物品于0.11MPa,121℃滅菌15分鐘后方可使用。第34頁,共81頁，2024年2月25日，星期天35

三、培養(yǎng)基的處置（1）培養(yǎng)基的配制一般采用商品脫水培養(yǎng)基，按照使用說明書進行配制，配制培養(yǎng)基時稱量要迅速，以免吸潮而影響稱量的準確性，同時為避免增加培養(yǎng)基中的金屬離子及其他微量化學(xué)元素而影響微生物的生長，所用器具應(yīng)為潔凈玻璃器皿，所用溶解用水為去離子水或蒸餾水。每個容器內(nèi)，培養(yǎng)基的裝量應(yīng)不超過容器體積的三分之二，以防加熱滅菌時培養(yǎng)基污染瓶塞。第35頁,共81頁，2024年2月25日，星期天36

（2）培養(yǎng)基的pH值

培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必需校正。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，使其高于規(guī)定值的0.2，滅菌后可達到規(guī)定的pH值，測定時溶液溫度應(yīng)為20～25℃，調(diào)節(jié)PH值可用1mol/L氫氧化鈉溶液、1mol/L鹽酸溶液。分裝好的培養(yǎng)基應(yīng)及時密封,必須在配制后2小時內(nèi)進行滅菌處理。第36頁,共81頁，2024年2月25日，星期天37（3）特殊配制的培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，作為厭氧和好氧檢查用培養(yǎng)基需要特別注意。培養(yǎng)基應(yīng)經(jīng)煮沸后分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基的氧化層(粉紅色)不超過培養(yǎng)基深度的1/2,在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的顏色不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則須置100℃水浴中加熱至粉紅色消失(不超過20分鐘)，迅速冷卻。培養(yǎng)基只限加熱一次，并防止被污染。第37頁,共81頁，2024年2月25日，星期天38（4）采用合理的滅菌方式培養(yǎng)基采用不適當?shù)募訜岷蜏缇鷹l件，有可能引起顏色變化，透明度降低，瓊脂凝固力降低或pH改變,因此滅菌應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序進行。第38頁,共81頁，2024年2月25日，星期天39四、供試液制備的基本知識1、供試品檢驗量和檢驗數(shù)量(1)檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm2）。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽性對照試驗）。第39頁,共81頁，2024年2月25日，星期天40(2)檢驗數(shù)量檢驗時,應(yīng)從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4片。一般應(yīng)隨機抽取不少于檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3倍量供試品。第40頁,共81頁，2024年2月25日，星期天412、稀釋劑各劑型及原輔料的供試品，一般均需用稀釋劑經(jīng)稀釋后作為供試液，對于液體制劑可以不稀釋，直接用原液作為供試液。常用的稀釋劑有：第41頁,共81頁，2024年2月25日，星期天42(1)0.9%氯化鈉溶液(2)pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液氯化鈉胨水緩沖液可調(diào)節(jié)供試液pH至近中性，其中蛋白胨對菌細胞有保護作用，有利于菌數(shù)及控制菌的測定，為最常用的稀釋劑?？梢园垂┰嚻返男再|(zhì)加入聚山梨酯80的稀釋劑對含油性供試品具有助溶作用。(3)pH6.8磷酸鹽緩沖液適用于腸溶制劑(4)pH7.6磷酸鹽緩沖液供結(jié)腸制劑做稀釋用第42頁,共81頁，2024年2月25日，星期天433、供試液制備的基本要求根據(jù)供試品的理化性質(zhì)及特性，采用經(jīng)驗證的方法制備成均勻的供試液，不得改變污染微生物的數(shù)量和種類，其要求如下：（1）供試液的制備，從取樣至制備呈均勻的供試液，必須在符合規(guī)定的潔凈級無菌室內(nèi)進行，試驗的全過程必須嚴格無菌操作，防止再污染。第43頁,共81頁，2024年2月25日，星期天44（2）采用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作供試品的稀釋劑，或根據(jù)供試品的理化性質(zhì)加入經(jīng)驗證的適宜的助溶劑、乳化劑、中和劑、使其成為均勻的溶液、混懸液或乳濁液。（3）含有抑菌成分的供試品，應(yīng)按其性質(zhì)減除抑菌活性對試驗的干擾并經(jīng)驗證試驗。（4）供試品按驗證方法制備成供試液后至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。第44頁,共81頁，2024年2月25日，星期天45五、供試液的制備方法

采用經(jīng)驗證的供試液制備方法，可采用以下1種方法，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。勻漿儀：利用勻漿儀高速旋轉(zhuǎn)可將固體供試品快速研細，將油性基質(zhì)的軟膏或易吸水的膠囊劑制備成均勻的供試液。該法快捷、高效、均質(zhì)、效果好，不易造成污染，為藥典優(yōu)選的方法。研磨法：利用研缽將固體供試品研細，將油性基質(zhì)的軟膏劑制備成均勻的供試液。本法勞動強度大，費時，開放式研磨，暴露時間長易造成污染。第45頁,共81頁，2024年2月25日，星期天46振蕩器法：將供試品及稀釋劑置入滅菌錐形瓶內(nèi)，置于振蕩器上震蕩，使固體供試品分散、均質(zhì)。本法簡便，但對水丸劑等堅硬的供試品效果欠佳，分散期長。乳化法：適用于非水溶性供試品如以凡士林為基質(zhì)的供試品的供試液的制備。在供試品中加入適宜的乳化劑、稀釋劑，使用乳化劑的種類和數(shù)量必須經(jīng)過驗證。第46頁,共81頁，2024年2月25日，星期天47萃取法：取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯，使油質(zhì)溶化，萃取，以水層作為供試液。適用于以凡士林為基質(zhì)的軟膏等供試品。加滅活劑：根據(jù)供試品含抑菌成分的理化性質(zhì)，加入適宜的滅活劑，以消除其抑菌活性，加入滅菌劑的種類和量必須通過驗證。第47頁,共81頁，2024年2月25日，星期天48

常用制備方法如下：

1.液體供試品取供試品10ml，加稀釋液至100ml，混勻，作為1:10供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑常用混合的供試品原液作為供試液。

第48頁,共81頁，2024年2月25日，星期天49

2.固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1OOml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1:10的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。第49頁,共81頁，2024年2月25日，星期天50

3.需要特殊方法制備供試液的供試品

（1）非水溶性供試品方法1：稱供試品5g（或5ml），加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌均勻后，慢慢加入45℃的稀釋液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20供試液。第50頁,共81頁，2024年2月25日，星期天51方法2取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（必要時可增加用量）的適宜容器中，充分振搖，使供試品溶解，然后加入45℃的稀釋液100ml，振搖5~10分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取水層作為1：10供試液。第51頁,共81頁，2024年2月25日，星期天52油劑取供試品10ml，加入無菌聚山梨酯805～8ml搖勻，再加入稀釋劑至100ml，作為l:10的供試液。栓劑取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置45℃水浴保溫10min,使溶，加入無菌聚山梨酯805～8ml振搖使之乳化，再加入稀釋劑至100ml，搖勻，作為l:10的供試液。第52頁,共81頁，2024年2月25日，星期天53

（2）膜劑供試品取供試品100cm2，剪碎，加100ml稀釋液（必要時可增加用量），浸泡，振搖，作為1：10的供試液。(3)腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）至100ml，置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為1：10的供試液。第53頁,共81頁，2024年2月25日，星期天54（4）氣霧劑、噴霧劑供試品取規(guī)定量供試品，置冰凍室冷凍約1小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的稀釋劑（若含非水溶性成份，加適量的無菌聚山梨酯80）中，混勻（此液即為供試品原液），取相當于10g或10ml的供試品，再稀釋成1：10的供試液。第54頁,共81頁，2024年2月25日，星期天55

（5）貼膏劑供試品取規(guī)定量供試品，去掉貼膏劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振搖至少30分鐘，制成供試液。也可采用其他適宜的方法制備成供試液。第55頁,共81頁，2024年2月25日，星期天56

（6）具抑菌活性的供試品當供試品有抑菌活性時，采用下列方法進行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。第56頁,共81頁，2024年2月25日，星期天57①培養(yǎng)基稀釋法取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時，取同稀釋級的供試液2ml，每1ml可等量分注多個平皿（2個、5個或10個平皿中（每皿0.5ml、0.2ml、0.1ml），傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計數(shù)。每1ml供試液所注的平皿中生長的菌落數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，計算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。該法只適用抑菌作用不強的供試品。第57頁,共81頁，2024年2月25日，星期天58②離心沉淀法取一定量的供試液，500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取全部上清液混合。用于細菌檢查。（取消了離心沉淀集菌法，該法回收率達不到要求）第58頁,共81頁，2024年2月25日，星期天59③薄膜過濾法見細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)項下的方法。（將在后面的章節(jié)中做詳細介紹。）第59頁,共81頁，2024年2月25日，星期天60④中和法

凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。表6-l常見干擾物的中和劑或滅活方法第60頁,共81頁，2024年2月25日，星期天61第三節(jié)、細菌、霉菌及酵母菌

一、概述

1．基本概念藥品細菌數(shù)測定是微生物的定量檢查，是用來判斷藥品被細菌污染程度和衛(wèi)生質(zhì)量評價的重要指標，也是檢測藥品質(zhì)量的重要指標之一。細菌計數(shù)是指在一定條件下（如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH值、培養(yǎng)溫度和時間等）每1g、1ml、10cm2供試液經(jīng)培養(yǎng)后所生長的菌落數(shù)。所謂一定條件是按我國藥典規(guī)定，在需氧或厭氧條件下，30～35℃，一般培養(yǎng)72小時，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上生長的細菌菌落數(shù)。細菌數(shù)的測定方法有多種；平皿法、薄膜過濾法、涂布法、MPN法是國內(nèi)外藥典收載的常用方法。第61頁,共81頁，2024年2月25日，星期天622．菌落數(shù)測定的意義藥品污染細菌的數(shù)量，是評價藥品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標。其意義可概括如下：（1）藥品染菌量與藥品的有效性相關(guān)。微生物在其污染的藥品是出于動態(tài)的不穩(wěn)定的狀態(tài)，隨著時間延長，它們可能暫時處于停滯或逐漸趨于死亡。但也可能在適宜的條件下，以藥物為營養(yǎng)生長繁殖，其結(jié)果使藥物產(chǎn)生一系列的物理和化學(xué)變化：外觀顏色的改變，潮解，氣味等；微生物對藥物的降解作用，使其有效成分迅速破壞、變質(zhì)而失去療效，藥物中污染細菌的數(shù)量與上述質(zhì)量變化有著必然的因果聯(lián)系，藥物中污染細菌數(shù)量越多，藥物變質(zhì)而迅速失效的可能性越大。尤其是有些細菌的分解產(chǎn)物、毒素，具有極強的毒性，直接危害人類的身體健康。第62頁,共81頁，2024年2月25日，星期天63（2）藥品染菌量與藥品的安全性相關(guān)。藥品染菌越多，致病性微生物的污染可能性越大。有人研究細菌數(shù)量和大腸菌群檢出率的關(guān)系，結(jié)果證明，藥品中細菌數(shù)量越多，大腸菌群檢出的幾率也就越高。大腸菌群的檢出，即意味著其它腸道致病菌存在的可能性增加。有資料表明，不同細菌數(shù)和各種致病菌的相互關(guān)系，例如細菌數(shù)（1～5）Χ104時，沙門菌陽性率為8%，產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性率為3%，金黃色葡萄球菌陽性率為57%。細菌數(shù)高，致病菌污染明顯增加，有可能直接危害人體健康。第63頁,共81頁，2024年2月25日，星期天64（3）藥品染菌量是藥品質(zhì)量的重要指標之一。細菌數(shù)是評價企業(yè)綜合管理水平的依據(jù)。因為要保證藥品的衛(wèi)生質(zhì)量，必須認真做到全面的質(zhì)量管理，即是考量管理人員水平、生產(chǎn)人員素質(zhì)、科學(xué)管理的標尺。第64頁,共81頁，2024年2月25日，星期天65二、計數(shù)方法1、基本計數(shù)方法計數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。按計數(shù)方法的驗證試驗確認的程序進行供試液制備。用稀釋液稀釋成1:10、1:l00、l:1000等稀釋級的供試液。(1)平皿法1)常規(guī)法：取經(jīng)驗證的低稀釋級的供試液lml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45℃的融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。第65頁,共81頁，2024年2月25日，星期天662)培養(yǎng)基稀釋法：取經(jīng)驗證的低稀釋級的供試液lml，等量分注于2個（2皿法，每皿0.5ml）、5個(5皿法，每皿0.2ml)或10個(10皿法，每皿0.1ml)直徑90mm的無菌平皿中，其它同上。陰性對照試驗

取試驗用的稀釋液lml，置無菌平皿中．注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板，均不得有菌生長。第66頁,共81頁，2024年2月25日，星期天672、薄膜過濾法采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜．沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。第67頁,共81頁，2024年2月25日，星期天68

水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml.，以避免濾膜上的微生物受損傷。第68頁,共81頁，2024年2月25日，星期天69取相當于每張濾膜含lg、lml或10ccm2供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g、lml或10cm2所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液lml進行試驗。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數(shù)方法的驗證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。陰性對照試驗取試驗用的稀釋液lml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。第69頁,共81頁，2024年2月25日，星期天70(2)培養(yǎng)和計數(shù)

培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。第70頁,共81頁，2024年2月25日，星期天713、培養(yǎng)和菌落計數(shù)

1)培養(yǎng)時間：除另有規(guī)定外，細菌30～35℃培養(yǎng)3天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，如菌落極小，不易辨認，可延長培養(yǎng)時間至5天；霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，必要時可適當延長培養(yǎng)時間至7天進行菌落計數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。第71頁,共81頁，2024年2月25日，星期天72

2)菌落計數(shù)：一般將平板置菌落計數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點計，以透射光襯以暗色背景，仔細觀察。勿漏計細小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長的菌落。注意細菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之間，以及菌落與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡、油滴等的區(qū)別。必要時用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察，或挑取可疑物涂片鏡檢。第72頁,共81頁，2024年2月25日，星期天73

若平板上有