基因診斷和基因治療

關于基因診斷和基因治療概念：

基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位于染色體上的一段特定DNA序列?；虻母淖?，會導致各種表型的改變，進而引起疾病的發(fā)生。

將基因或其組成部分發(fā)生異常的疾病統(tǒng)稱為基因病。第2頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因病分為三大類：一、單基因?。河蓡蝹€基因突變引起的一類疾病。如：血友病、地中海貧血等。二、多基因?。河啥鄠€基因突變綜合作用引起的疾病。如：惡性腫瘤、高血壓、動脈硬化、糖尿病、先天畸形等、三、獲得性基因?。褐竿庠椿颍―NA）侵入，在機體產(chǎn)生疾病，一旦將其清除便可痊愈。如：艾滋病及各種微生物感染病。第3頁,共73頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基因診斷（DNAdiagnosis）一、基因診斷的概念和基本概況臨床診斷生化學診斷免疫學診斷臨床疾病診斷四種方式：以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)。（細胞形態(tài)結構變化、代謝產(chǎn)物異常、特定蛋白分子識別差異等）基因診斷對患者基因直接分析第4頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因診斷定義（概念）：

基因診斷是利用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學的技術方法，直接檢測患者體內基因結構及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷或輔助診斷?；蛟\斷是在DNA/RNA水平檢測分析基因的存在、結構變異和表達狀態(tài)，與傳統(tǒng)診斷方法比較有其特點：第5頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因診斷的特點：1、病因診斷：直接瞄準病理基因，不僅對表型出現(xiàn)的疾病作出診斷，還可能發(fā)現(xiàn)潛在的致病因素，如:確定有遺傳家族史的人攜帶致病基因。2、特異性強、靈敏度高：選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴增PCR技術。3、穩(wěn)定性高4、診斷范圍廣，適應性強目的基因是否處于活化狀態(tài)均可。樣品可長期保存?？蓹z測正在生長的病原體或潛在病原體。（與以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)的診斷技術相比）第6頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因診斷的基本概況：伴隨分子生物學理論技術的發(fā)展而建立和發(fā)展。DNA雙螺旋遺傳密碼破譯DNA重組癌基因與抑癌基因研究地中海貧血病基因治療和逆轉錄病毒載體開發(fā)

PCR、分子雜交等一系列技術發(fā)展第7頁,共73頁，2024年2月25日，星期天二、基因診斷的對象1、病原生物的侵入病原體：病毒、支原體、細菌、寄生蟲檢查診斷方法：顯微鏡、免疫學方法、基因診斷等。尤其是當無抗體時，基因診斷成為唯一手段。2、先天遺傳性疾病遺傳性疾病:發(fā)病的原因為特定基因的突變。第8頁,共73頁，2024年2月25日，星期天腫瘤的發(fā)生：

發(fā)病機理尚不請。

初步認為是個別細胞基因突變而引起的細胞無限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突變引起的疾病二、基因診斷的對象第9頁,共73頁，2024年2月25日，星期天

（1）用核心順序的串聯(lián)重復序列組成探針進行雜交研究，可同時檢出具有高度多態(tài)性位點。（2）用southern雜交得到DNA指紋圖譜個體識別、親子鑒定、法醫(yī)物證4、其他二、基因診斷的對象遺傳穩(wěn)定，個體特異，因而用于法醫(yī)和親子鑒定。第10頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因診斷的基本策略：1、檢測已知的能產(chǎn)生某種特定功能蛋白的基因

這些基因根據(jù)其特定功能已被克隆，并被定位在染色體上，基因序列亦被測定，致病時的基因改變亦較清楚。如：已被克隆的病毒、細菌、霉菌和寄生蟲的基因、與致病有關的癌基因、抗癌基因、

地中海貧血、苯丙酮尿癥等遺傳病基因。第11頁,共73頁，2024年2月25日，星期天2、檢測與某種遺傳標志連鎖的致病基因遺傳連鎖－－同一染色體相鄰的二個或二個以上的基因或限制性酶切位點，由于位置十分靠近，在遺傳時分離幾率很低，常一起遺傳稱連鎖。染色體遺傳連鎖圖－－用限制性內切酶酶切位點作遺傳標志，定位與之相連鎖的正?；蚺c致病基因，建立相應的遺傳連鎖圖譜。定位性克?。鶕?jù)遺傳連鎖圖進行定位性克隆。比較正常和異?；虻牟顒e，可找出導致遺傳病的分子缺陷。定位性克隆策略是當前基因診斷的重要基礎。第12頁,共73頁，2024年2月25日，星期天3、檢測表型克隆基因針對多基因?。ㄈ纾褐囟确逝帧⑾?、高血壓、癲癇、精神病、多種自身免疫性疾?。?。表型克隆技術－－是將有關表型與基因結構結合，直接分離該表型的相關基因，并對疾病相關的一組基因進行克隆，然后用作多種探針，來診斷多基因遺傳病。該策略既不需預先知道基因的生化功能或圖譜定位，也不受基因數(shù)目及其相互作用方式的影響。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和異常基因組尋找兩者之間的差異序列2、基因組錯配篩選技術：尋找兩者的全同序列，分離、鑒定與疾病相關的基因，確定導致疾病的分子缺陷第13頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因診斷的基本步驟：1、獲得待檢樣品：提取核酸（PCR提高靈敏度)2、制備和標記核酸探針3、基因檢測分析第14頁,共73頁，2024年2月25日，星期天三、基因診斷的常用技術核酸分子雜交聚合酶鏈反應（PCR）限制性片段長度多態(tài)性（RELP）擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）等位基因特異的寡核苷酸（ASO）單鏈構象多態(tài)性（SSCP）基因芯片第15頁,共73頁，2024年2月25日，星期天1、核酸分子雜交原理：利用核酸的變性、復性及堿基互補的性質，用已知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組DNA/RNA雜交，檢測核酸樣品中是否存在與探針互補的同源核酸序列，進行DNA或RNA定性定量分析?；驒z驗的兩個必要條件：1、必需的特異探針（標記的）2、必需的基因組DNA第16頁,共73頁，2024年2月25日，星期天核酸分子雜交－－核酸印跡雜交DNA印跡雜交（Southernblot）RNA印跡雜交（Nouthernblot）斑點印跡雜交（Dot-blot）原位雜交(situhybridization)第17頁,共73頁，2024年2月25日，星期天核酸印跡雜交基本過程：提取DNA或RNA→酶切→凝膠電泳→膠變

性處理（DNA）→轉印核酸片段到NC膜上。

（RNA可直接用變性膠電泳，轉膜）1、制備樣品：第18頁,共73頁，2024年2月25日，星期天核酸印跡雜交基本過程：（2）制備探針：探針：一段能和待檢測核酸分子按堿基互補配對原則而結合的核酸分子片段。探針需要標記可直接檢測的元素或分子。

如：同位素、熒光、生物素等第19頁,共73頁，2024年2月25日，星期天核酸印跡雜交基本過程：核酸印跡雜交可檢測pg水平的靶分子（4）檢測：方法依標記的探針而不同*放射性同位素*生物素*地高辛*熒光素（3）雜交：預雜交－－封閉非特異性結合位點雜交－－探針與核酸分子結合第20頁,共73頁，2024年2月25日，星期天核酸印跡雜交基本過程：第21頁,共73頁，2024年2月25日，星期天2、聚合酶鏈反應（PCR)原理：以待擴增DNA為模板，在互補模板兩端序列的寡核苷酸引物介導下，通過耐高溫DNA聚合酶催化下，按半保留復制機制延模板鏈延伸，快速、特異地擴增特定的DNA。一種體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術。（無細胞分子克隆技術）。第22頁,共73頁，2024年2月25日，星期天耐高溫DNA聚合酶－－－Taq酶寡核苷酸引物：設計引物和確定退火溫度是PCR

成功的關鍵。PCR的基本過程：（循環(huán)程序）變性（95℃）→退火（55℃－65℃）→延伸（72℃）3～5分40’’～1分100bp/1分源自水棲高溫菌，最適反應溫度為72℃，且經(jīng)90℃以上加溫后仍可在溫度恢復后復性。第23頁,共73頁，2024年2月25日，星期天（呈2n擴增速度）PCR基本過程和原理特點：特異性強靈敏度高樣品可以是：毛發(fā)、血痕單細胞、病原體、腫瘤殘留物、犯罪現(xiàn)場遺留物第24頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因診斷中常用的PCR技術：（1）、DNAPCR：（2）、RT-PCR：以DNA為模板，擴增特定核苷酸序列。用于檢測特定基因片段的存在，分析鑒定基因突變。以總RNA或mRNA為模板，逆轉錄為cDNA后擴增。用于檢測特定基因表達水平的主要方法之一。（3）、PCR-SSCP：檢測基因未知突變的常用技術。簡單、快捷、靈敏。第25頁,共73頁，2024年2月25日，星期天（4）、多重PCR：指在一次PCR反應中加入多對引物，同時擴增DNA序列上不同序列片段的一種PCR技術。用于一些“超大”基因中大片段缺失分析。（5）、原位PCR：直接用組織切片和細胞進行PCR或RT-PCR，在組織、細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特點基因序列。（6）、實時定量PCR：借助特異性結合DNA的熒光染料，實時動態(tài)檢測PCR擴增的DNA量的變化。第26頁,共73頁，2024年2月25日，星期天其他重要的PCR衍生技術反向PCR（IPCR）標記引物PCR（labelledprimersPCR）錨定PCR（anchoredPCR）差異展示PCR（DD-PCR）（見書“分子生物學技術”章節(jié)）第27頁,共73頁，2024年2月25日，星期天3、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）檢出方法：Southern印跡概念：用同一限制性內切酶完全切割同一物種的不同個體的基因組DNA，出現(xiàn)分子質量不同的同源片段，這種由限制性內切酶酶切位點變化導致的DNA片段差異，稱限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）。人類基因組中由中性突變導致個體間核苷酸的差異稱－－DNA多態(tài)性第28頁,共73頁，2024年2月25日，星期天RFLP類型：2、由于鏈內發(fā)生較大片段的缺失、重復、插入和重排導致DNA順序的變化，因而酶切片段改變－－－序列多態(tài)性。1、單個堿基的突變引起酶切位點的變化－－－點多態(tài)性致病基因附近或內部一般存在RFLP,可用于連鎖分析的基因診斷。第29頁,共73頁，2024年2月25日，星期天（四）擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）

應用于基因突變性質不明的連鎖分析。AFLP－－串聯(lián)重復的短片段的長度多態(tài)性通過PCR擴增,經(jīng)限制性內切酶酶切后電泳,產(chǎn)生顯示擴增片段多態(tài)性。第30頁,共73頁，2024年2月25日，星期天AFLP原理：首先利用可產(chǎn)生粘性末端的限制性內切酶酶切研究對象的基因組序列，產(chǎn)生不同長度的酶切片段。然后，將這些酶切片段與含有與其有共同粘性末段的人工接頭連接，形成模板。為達到選擇性擴增的目的，再在模板末端添加具有選擇性核苷酸（1～3個）的不同引物，然后PCR擴增，結果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對的酶切片段被擴增。最后將被擴增的片段在高分辨率的測序凝膠上電泳，這樣其多態(tài)性即根據(jù)擴增片段的長度與數(shù)量的不同而被分開。PCR擴增產(chǎn)物即等位片段之間差別只有幾個bp。第31頁,共73頁，2024年2月25日，星期天5、等位基因特異的寡核苷酸（ASO）方法：1、合成兩種探針：①已知突變位點的核苷酸序列（M）

②正常基因堿基序列（N）2、雜交實驗結果：M+N-受檢者是突變基因的純合子M-N+受檢者是不存在突變基因M-N-受檢者的缺陷基因可能是一種新的突變類型M+N+受檢者是突變基因的雜合子原理：

已知基因突變部位和性質，合成基因特異的核苷酸探針（20bp），標記后與受檢者DNA雜交診斷。（可與PCR聯(lián)用：PCR-ASO）第32頁,共73頁，2024年2月25日，星期天6、單鏈構象多態(tài)性（SSCP）日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，當有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構象，使構象發(fā)生改變，空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構象上有差異的分子分離開.PCR-SSCP第33頁,共73頁，2024年2月25日，星期天PCR-SSCP基本過程①PCR擴增靶DNA②將特異的PCR擴增產(chǎn)物變性后快速復性;③將單鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;④通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構象發(fā)生改變，進而推斷該DNA片段中有堿基突變.第34頁,共73頁，2024年2月25日，星期天7、基因芯片

將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測根據(jù)雜交分子和未雜交分子信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數(shù)量?；驹恚海ㄉ锛赡Ｆ?、DNA陣列、或寡核苷酸微芯片）第35頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因芯片技術：第36頁,共73頁，2024年2月25日，星期天目的：檢測外源性基因的侵入目標：1、微生物2、病毒如：HIV（致艾滋病AIDS）3、寄生蟲、4、不易體外培養(yǎng)的病原體（毒性大腸桿菌、麻風分枝桿菌）5、實驗室培養(yǎng)的病原體（克立氏體）四、基因診斷的臨床應用:1、在感染性疾病檢測中應用第37頁,共73頁，2024年2月25日，星期天艾滋病與HIV病毒艾滋病由HIV通過接觸、血液、血制品及母嬰傳播感染所致。HIV特異地侵犯輔助性T細胞（CD4），引起人體細胞免疫嚴重缺陷，導致頑固的機會性感染，惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。HIV感染后，95%感染者5個月可檢出抗體（也有3-4年仍不能檢出抗體）。有必要進行PCR技術檢測。第38頁,共73頁，2024年2月25日，星期天艾滋病與HIV病毒檢測技術：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析引物的設計：應在保守區(qū)（基因：pol,env,gag,tat)病毒特點：HIV病毒由兩條單鏈RNA組成，9.7k/RNA，主要基因結構和組成形成與其他逆轉錄病毒相同，但較之復雜，故稱復雜反轉錄病毒HIV屬反轉錄病毒－－－即單鏈RNA反轉錄成雙鏈DNA，進入宿主細胞染色體。第39頁,共73頁，2024年2月25日，星期天非典型性肺炎（SARS）由一種新型冠狀病毒（SARS-CoV）引起，多種途徑傳播，傳染性強、高致死率的急性疾病。診斷依靠：流行病學、臨床表現(xiàn)、放射診斷、血清學（熒光免疫、ELISA）PCR作為一種靈敏的早期病原學診斷必不可少（關鍵是引物的合成）第40頁,共73頁，2024年2月25日，星期天2、在遺傳病檢測中的應用

產(chǎn)前診斷檢測妊娠8－12周的絨毛DNA或羊水細胞

PCR診斷一系列遺傳疾病鐮刀狀細胞貧血的診斷方法：－RFLP診斷

MstⅡ酶切識別序列：CCTNAGG切割正常β鏈序列：CCTGAGG不切割突變序列：CCTGTGG

－ASO探針診斷第41頁,共73頁，2024年2月25日，星期天3、在腫瘤檢測中的應用原癌基因生物正常細胞基因中編碼關鍵性調控蛋白的癌基因抑癌基因一類抑制細胞增殖的基因，其失活可引起細胞轉化。兩類基因協(xié)同調控，使細胞生長處于平衡狀態(tài)。第42頁,共73頁，2024年2月25日，星期天癌基因激活變化及檢測：1、基因擴增：即染色體某區(qū)段基因拷貝數(shù)增加，或癌基因的擴增。檢測方法：Southern雜交定量PCR2、基因的過量表達：包括基因擴增基礎上的過量表達及非

DNA水平的過量表達。檢測方法：Northern雜交RT-PCR3、點突變：檢測方法為各種基于PCR的方法。第43頁,共73頁，2024年2月25日，星期天抑癌基因的檢測：SouthernPCR大片段的缺失、和點突變*兩個等位抑癌基因突變才能引起腫瘤，需檢出兩個等位抑癌基因。方法：RFLP結合PCR，進行缺失檢測

點突變主要采用PCR第44頁,共73頁，2024年2月25日，星期天腫瘤標志物：指特征性存在于惡性腫瘤或由惡性腫瘤細胞異常產(chǎn)生的物質或宿主對腫瘤反應而產(chǎn)生的物質。（1）酶類腫瘤標志物（2）激素類標志物（3）胚胎抗原（4）特殊蛋白標志物（5）糖蛋白類抗原（6）血中癌基因蛋白（7）唾液酸和唾液酸?；D移酶（8）多胺免疫組化篩選提高檢出率第45頁,共73頁，2024年2月25日，星期天法醫(yī)學鑒定針對人類DNA遺傳差異進行的個體識別和親子鑒定。常用技術:DNA指紋分析（VNTR）短串聯(lián)重復序列（STR）遺傳特征分析PCR-擴增片段長度多態(tài)性（AmP-FLP)PCR-mtDNA技術根據(jù)可變串聯(lián)重復序列（小衛(wèi)星DNA）多態(tài)性

高度的個體特異性第46頁,共73頁，2024年2月25日，星期天DNA指紋（圖譜）分析：⑴、選擇核心序列作探針，選在核心序列上無切割位點的限制性內切酶，酶解樣品，Southernblot得到DNA指紋圖譜。針對可變串聯(lián)重復序列（VNTR）（VNTR是判斷個體的遺傳標志）⑵、針對VNTR側翼保守區(qū)序列設計探針，用PCR

對該區(qū)擴增，電泳得到個體之間長度不同的條帶圖譜。（VNTR片段較長PCR不易擴增）。第47頁,共73頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)基因治療（genetherapuy)概念：

將外源正?；驅氚屑毎?，以糾正或補償因缺陷和異常基因引起的疾病，達到治療目的。導入的基因可以與缺陷基因對應、在體內表達具有特異功能的同源基因、也可以是與缺陷基因無關的治療基因。概念的擴展：凡是采用分子生物學方法原理，將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發(fā)揮作用，達到治療目的的方法，都可稱為基因治療。第48頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因治療策略:總原則：－－直接補替缺陷基因－－抑制非正?；虍a(chǎn)物表達－－間接調節(jié)機體本身免疫系統(tǒng)的抗病能力。－－利用外源基因對病變細胞造成特異性殺傷第49頁,共73頁，2024年2月25日，星期天1、基因矯正－－將致病基因的堿基進行糾正，而正常部分予以保留。2、基因置換－－用正?；蛲ㄟ^體內基因同源重組，原位置換病變細胞內的致病基因，使細胞內的DNA完全恢復正常3、基因增補－－將目的基因導入病變細胞或其它細胞，不去除異常基因，而是通過目的基因的非定點整合，使其表達產(chǎn)物補償缺陷基因的功能或使原有功能得以加強。4、基因失活－－利用反義技術特異封閉基因表達，抑制有害基因的表達。5、免疫調節(jié)－－將抗體、抗原或細胞因子的基因導入病人體內，改變病人免疫狀態(tài)，達到預防和治療的目的?；蛑委煹牟呗裕旱?0頁,共73頁，2024年2月25日，星期天6、調節(jié)性基因治療：導入編碼調控蛋白的基因，治療基因表答異常的疾病7、化療保護性基因治療：導入單相或多相細胞毒性藥物的抗性基因，使正常細胞耐受化療藥物的能力大大提高。8、特異性細胞殺傷性基因治療：利用DNA重組技術構建特異性殺傷靶細胞為目標的“奇異彈頭”，“彈頭”部分是分子重組的各種生物細胞毒素，它們以酶催化方式發(fā)揮抑制蛋白合成作用，造成細胞殺傷。9、生殖細胞基因治療：生殖細胞或胚胎干細胞補償性治療第51頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因治療基本程序;方法：1、體外法（exvivo):2、體內法

(invivo):將受體細胞在體外培養(yǎng)，轉入外源基因，經(jīng)適當選擇系統(tǒng)，將重組的受體細胞回輸患者體內，以改善癥狀。（普遍采用）直接將外源基因導入體內有關的組織器官,使其進入相應的細胞并轉錄、表達而發(fā)揮治療作用。基本程序：選擇目的基因選擇基因載體選擇靶細胞基因轉移外源基因表達及檢測回輸體內第52頁,共73頁，2024年2月25日，星期天治療基因的來源：1、野生型基因：

單基因缺陷遺傳病基因

反義核酸封閉活化的原癌基因

轉入相關的抑癌基因，抑制腫瘤2、重組DNA和分子克隆技術，人工合成特異基因。1、選擇治療的目的基因第53頁,共73頁，2024年2月25日，星期天用于基因治療的基因應滿足以下條件：（1）體內僅少量表達就可顯著改善癥狀。（2）該基因的過量表達不會對機體造成危害、（3）在抗病毒和抗病原體的基因治療中，所選擇的靶基因應在病毒和病原體的生活史中起重要作用，并且該序列是特異的。第54頁,共73頁，2024年2月25日，星期天理想的載體具有以下特征：1、容易生產(chǎn)

商業(yè)化生產(chǎn)，廣泛應用，易運輸，易保存2、持續(xù)表達

一旦轉入體內，應能在一定時間內持續(xù)表達基因產(chǎn)物，或能通過某種方法精細調節(jié)其表達。3、弱免疫源

轉入后不應引起免疫反應。4、組織靶向性

定向輸入某種細胞。5、包裝容量載體對轉染基因的大小應沒有限制。6、復制、分裂和整合能力：特異性定位整合，或以游離基因形式存在于細胞核內。7、能感染分裂期細胞和未分裂期細胞2、選擇基因載體：第55頁,共73頁，2024年2月25日，星期天基因載體：非病毒載體（裸DNA、脂質體）

病毒載體

（反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒）分類：優(yōu)點：大量生產(chǎn)，毒性小，低免疫性缺點：效率低。優(yōu)點：多數(shù)病毒可感染特異細胞，不易降解，

RNA病毒能整合到宿主染色體，表達水平高等。第56頁,共73頁，2024年2月25日，星期天病毒介導的基因轉移1、逆轉錄病毒：正鏈RNA病毒第57頁,共73頁，2024年2月25日，星期天逆轉錄病毒結構:基因組組成：（1）5’－帽子；3’－尾巴；（2）每個單鏈RNA含6個區(qū)：5’-LTR（長末端重復序列）

Ψ+（組裝所需的非編碼序列）gag（編碼衣殼結構蛋白基因）pol（編碼反轉錄酶基因）env（編碼外殼蛋白基因）3’-LTR第58頁,共73頁，2024年2月25日，星期天逆轉錄病毒生活周期:1、感染靶細胞2、利用自身編碼的逆反轉錄酶，以RNA為模板合成DNA。3、將病毒DNA轉運至宿主細胞核4、病毒DNA整合到宿主染色體5、以病毒DNA為模板轉錄RNA6、在細胞中翻譯Gag、Pol和Env蛋白7、形成衣殼，RNA單鏈和反轉錄酶一起包裝進衣殼。8、形成病毒顆粒并分泌到胞外。第59頁,共73頁，2024年2月25日，星期天逆轉錄病毒病毒RNA宿主細胞RTRT逆轉錄酶cDNA雙鏈插入基因組DNA逆轉錄病毒感染過程病毒RNA第60頁,共73頁，2024年2月25日，星期天構建逆轉錄病毒載體：（1）構建重組野生性病毒：插入相關外源基因，改造成DNA載體（包括插入選擇性標記），替代病毒的編碼基因。（2）制備輔助細胞（293T細胞），為載體DNA提供其喪失的功能。（3）載體DNA導入輔助細胞，產(chǎn)生病毒載體。（4）用病毒載體感染細胞，外源基因在宿主細胞中表達。第61頁,共73頁，2024年2月25日，星期天逆轉錄病毒載體的缺陷：1、只能轉染處于增殖狀態(tài)的細胞2、所攜帶的外源基因不能太大。3、感染依賴靶細胞表面受體的限制4、理論上不擴散其它細胞，但某些情況會造成野生型病毒爆發(fā)。5、有致細胞癌變的可能。6、逆轉錄病毒不能耐受純化和濃縮過程。第62頁,共73頁，2024年2月25日，星期天腺相關病毒(AVV)一種小的、非致病的、單鏈DNA病毒。是從屬病毒，需要其他基因才能復制。結構：rep基因－－編碼病毒的復制、整合功能所需蛋白

cap基因－－編碼病毒結構組分

ITRs序列－－反向末端重復，定義基因的開始和結束，制約DNA序列大小，包裹入衣殼。細胞對AVV病毒的親和力高，AVV載體適用范圍廣泛。第63頁,共73頁，2024年2月25日，星期天骨髓細胞、皮膚成纖維細胞、肝細胞、血管內皮細胞、肌細胞選擇原則:1、較堅固，耐受處理，易于由人體分離，便于輸回體內。2、具有增殖優(yōu)勢，生命周期長，能存活幾個月或幾年，至病人的整個生命。3、易于受外源遺傳物質的轉化。4、在選用病毒載體時，目的基因具表達最好具有組織特異性的細胞3、選擇靶細胞（禁止使用生殖細胞，只能用體細胞）第64頁,共73頁，2024年2月25日，星期天1、骨髓細胞：最被重視和常用的靶細胞。