微生物生理生長

關(guān)于微生物生理生長一、微生物生長的測量（一）測定微生物總數(shù)1、顯微鏡直接計數(shù)法2、比濁法3、Coulter計數(shù)器法4、膜過濾法（二）測定活細菌數(shù)1、平板計數(shù)法2、薄膜過濾計數(shù)法3、最近似法（MPN法）（三）測定細胞物質(zhì)量1、稱量法2、含氮測定法3、DNA測定法第2頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1、血球計數(shù)板法計數(shù)原則：只計數(shù)上方和右方線上（或下方和左方線）細胞個數(shù)（個/mL）=平均每小格內(nèi)細胞數(shù)*400*104*稀釋倍數(shù)第3頁,共89頁，2024年2月25日，星期天適用范圍：個體較大細胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細菌等個體較小的細胞。原因：（1）細菌細胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。特點：快速，準確，直觀，在菌懸液中加入少量美藍可以區(qū)分死活細胞。第4頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2、比濁法原理：是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應出菌液的濃度。特點：快速、簡便；但易受干擾。第5頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3、coulter計數(shù)器原理主要為測定通過儀器開口處電解質(zhì)溶液的電阻而求得粒子數(shù)目。利用細菌通過微孔時引起電流脈沖自動計數(shù)。第6頁,共89頁，2024年2月25日，星期天4、膜過濾法操作：取已知體積的水樣品，通過一個膜過濾器，此膜經(jīng)干燥后，進行細胞染色，使之與膜背景對比清楚，在顯微鏡下對一定面積的膜上細胞計數(shù)。適用：細胞總數(shù)小于106個/mL的水樣品（海水、湖水或飲用水等含菌數(shù)通常不十分多）第7頁,共89頁，2024年2月25日，星期天5、平板計數(shù)法第8頁,共89頁，2024年2月25日，星期天技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴格無菌操作；注意事項：每一支吸管只能用于一個稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時的培養(yǎng)基溫度；適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物；誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當操作。第9頁,共89頁，2024年2月25日，星期天6、薄膜過濾計數(shù)法操作：將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進行培養(yǎng)，然后計算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。適用：測定含菌量很少的空氣和水中的微生物數(shù)目。第10頁,共89頁，2024年2月25日，星期天首先將待分離的樣品進行連續(xù)稀釋，目的是得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物。如果經(jīng)過稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是由一個微生物個體繁殖而來的純培養(yǎng)物。將最終的稀釋液用作接種物接種于一批試管中培養(yǎng)，部分試管因細菌繁殖而渾濁，另一些無細菌生長而澄清。據(jù)有無細菌生長的試管數(shù)目，查MPN（mostprobablenumber,最大可能數(shù)）表，可估算出樣品的含菌量。7.最近似法（MPN法)第11頁,共89頁，2024年2月25日，星期天常用于食品和水的衛(wèi)生檢測中，也常用于因細菌數(shù)過低不宜采用稀釋培養(yǎng)法的場合。第12頁,共89頁，2024年2月25日，星期天8、稱量法通過離心或過濾收取菌體，在100℃左右烘干，測出干重，干重一般為濕重的20%--25%。以乳酸菌為例，在液體培養(yǎng)基中，細胞濃度大約為2*108個/mL，細菌一個細胞一般重10-12--10-13g，100mL培養(yǎng)物可得10---70mg干重的細胞。第13頁,共89頁，2024年2月25日，星期天9、含氮測定法通過測定微生物細胞的含氮量，確定微生物的量，單細胞微生物的氮含量約占細胞干重的8%--15%，絲狀真菌的氮含量約占細胞干重的5%。凱氏定氮法：粗蛋白含量=含氮量*6.25第14頁,共89頁，2024年2月25日，星期天10、DNA測定法DNA與3,5-二氨基苯甲酸-鹽酸溶液能顯示特殊的熒光反應；一定容積的菌懸液，通過熒光反應強度，求得DNA含量；每個細菌平均含DNA8.4*10-5ng,進而計算細菌數(shù)量。第15頁,共89頁，2024年2月25日，星期天二、微生物群體生長規(guī)律1.培養(yǎng)方法分批培養(yǎng)：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補充和更換，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時間地處于對數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。連續(xù)培養(yǎng)理論基礎(chǔ)：由于對典型生長曲線中穩(wěn)定期到來原因的認識，采取相應有效措施推遲其來臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。第16頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2、微生物的群體生長☆無分支單細胞微生物主要包括細菌和酵母菌，其群體生長是以群體中細胞數(shù)量的增加來表示的?！钣梢粋€細胞分裂成為兩個細胞的時間間隔稱為世代，一個世代所需的時間就是代時（Ｇenerationtime,G），代時也就是群體細胞數(shù)目擴大一倍所需時間，有時也稱為倍增時間。

右圖表示的是一個細胞經(jīng)過若干代分裂后的情況。右圖可見，每經(jīng)過一個代時，細胞數(shù)目就增加一倍，呈指數(shù)增加，因而被稱為指數(shù)生長，這就是單細胞群體生長的特征。（1）無分支單細胞微生物的群體生長特征第17頁,共89頁，2024年2月25日，星期天★代時能夠反應細菌的生長速率，代時短，生長速率快，代時長，生長速率慢。在很多微生物學研究中常常要了解微生物的代時?！锎鷷r在不同種微生物中的變化很大，多數(shù)微生物的代時為1~3h,然而有些快速生長的微生物的代時還不到10min,而另一些微生物的代時卻可長達幾小時或幾天；另外，同一種微生物，在不同的生長條件下其代時的長短也不同；但是，在一定條件下，每一種微生物的代時是恒定的，因此它是微生物菌種的一個重要特征。第18頁,共89頁，2024年2月25日，星期天（2）無分支單細胞微生物的群體生長曲線☆以細菌為例介紹無分支單細胞微生物群體生長規(guī)律，其結(jié)論也基本適用于酵母菌?！钌L曲線代表了細菌在新的環(huán)境中從開始生長、分裂直至死亡的整個動態(tài)變化過程?！蠲糠N細菌都有各自的典型生長曲線，但它們的生長過程卻有著共同的規(guī)律性。一般可以將生長曲線劃分為四個時期。第19頁,共89頁，2024年2月25日，星期天其它名稱：停滯期、調(diào)整期、適應期a.現(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平行于橫軸。b.特點：生長速率常數(shù)R=0細胞形態(tài)變大或增長細胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高，原生質(zhì)嗜堿性增強合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產(chǎn)生誘導酶對外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學藥物）c.原因：適應新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物①.延滯期（lagphase）第20頁,共89頁，2024年2月25日，星期天◆菌種：繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短；◆接種物菌齡：用對數(shù)生長期的菌種接種時，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期；◆接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）；◆培養(yǎng)基成分：在營養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長時短；接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時，會使延滯期加長，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近?！镉绊懷舆t期長短的因素：第21頁,共89頁，2024年2月25日，星期天認識延遲期的特點對實踐的指導意義：◆在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期；采取的縮短lagphase的措施有：①增加接種量；（群體優(yōu)勢----適應性增強）②采用對數(shù)生長期的健壯菌種；③調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分;④選用繁殖快的菌種第22頁,共89頁，2024年2月25日，星期天②.對數(shù)期（logarithmicphase）其他名稱：指數(shù)期a.現(xiàn)象：細胞數(shù)目以幾何級數(shù)增加，其對數(shù)與時間呈直線關(guān)系。b.特點：菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致處于該期的細胞對理化因素較敏感菌體代謝活躍，消耗營養(yǎng)物質(zhì)多，生長速率快，菌體數(shù)目顯著增多。c.影響因素：菌種、營養(yǎng)成分、營養(yǎng)物濃度、培養(yǎng)溫度第23頁,共89頁，2024年2月25日，星期天①由于此時期的菌種比較健壯，增殖噬菌體的最適菌齡，生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達到較高的菌體密度；③食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進入此期；④是生理代謝及遺傳研究或進行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。認識對數(shù)期的特點對實踐的指導意義：第24頁,共89頁，2024年2月25日，星期天③.穩(wěn)定期（stationaryphase）又稱：恒定期、最高生長期a.特點：

生長速率常數(shù)R等于0菌體產(chǎn)量達到了最高值合成次生代謝產(chǎn)物細胞內(nèi)出現(xiàn)儲藏物質(zhì)，芽孢菌內(nèi)開始產(chǎn)生芽孢b.影響因素：菌種、環(huán)境條件c.產(chǎn)生原因：營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡營養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不合適有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）物化條件（pH、氧化還原勢等）不合適第25頁,共89頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應盡量延長此期，提高產(chǎn)量，措施如下：補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）、調(diào)pH、調(diào)整溫度穩(wěn)定期細胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達到最高認識穩(wěn)定期的特點對實踐的指導意義：第26頁,共89頁，2024年2月25日，星期天④.衰亡期（declinephase）a.特點：

R為負值細胞的形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)不規(guī)則的衰退形釋放次生代謝產(chǎn)物，芽孢等菌體開始自溶b.影響因素：菌種、環(huán)境條件c.產(chǎn)生原因：生長條件的進一步惡化，使細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體的死亡。第27頁,共89頁，2024年2月25日，星期天(3)絲狀微生物的群體生長特征及曲線絲狀微生物的純培養(yǎng)采用孢子接種，在液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)或深層通氣加攪拌培養(yǎng)，菌絲體通過斷裂繁殖不形成產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)?？梢杂镁z干重作為衡量生長的指標，即以時間為橫坐標，以菌絲干重為縱坐標，繪制生長曲線。第28頁,共89頁，2024年2月25日，星期天a.生長停滯期:造成生長停滯的原因一是孢子萌發(fā)前真正的停滯狀態(tài)，另一種是生長已經(jīng)開始，但還無法測定。b.迅速生長期:菌絲體干重迅速增加，其立方根與時間呈直線關(guān)系，菌絲干重不以幾何級數(shù)增加，沒有對數(shù)生長期。生長主要表現(xiàn)在菌絲尖端的伸長和出現(xiàn)分支、斷裂等，此時期的菌體呼吸強度達到高峰，有的開始積累代謝產(chǎn)物。c.衰退期:菌絲體干重下降，到一定時期不再變化。大多數(shù)次級代謝產(chǎn)物在此期合成，大多數(shù)細胞都出現(xiàn)大的空泡。有些菌絲體還會發(fā)生自溶菌絲體，這與菌種和培養(yǎng)條件有關(guān)。第29頁,共89頁，2024年2月25日，星期天原理：當微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達到對數(shù)期后期時，一方面以一定的速度流進新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達到動態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。單批培養(yǎng)恒濁法恒化法單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時間連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液lg細胞數(shù)（個/ml）連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)原理第30頁,共89頁，2024年2月25日，星期天連續(xù)培養(yǎng)器按控制方式分按培養(yǎng)器的級數(shù)分按細胞狀態(tài)分按用途分內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長速率）：恒化器單級連續(xù)培養(yǎng)器多級連續(xù)培養(yǎng)器一般連續(xù)培養(yǎng)器固定化細胞連續(xù)培養(yǎng)器實驗室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐連續(xù)培養(yǎng)器第31頁,共89頁，2024年2月25日，星期天概念：通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。原理：通過調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來維持菌濃度不變,即濁度不變。主要采用恒濁器，當濁度高時，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。特點：基質(zhì)過量，微生物始終以最高速率進行生長，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復雜，煩瑣。使用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。放線菌以及霉菌等形成菌絲的微生物不能通過恒濁器來連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒濁培養(yǎng)第32頁,共89頁，2024年2月25日，星期天連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使營養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細菌生長速率恒定的方法。原理：通過控制某一種營養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長因子等），使其始終成為生長限制因子，而達到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進行生長繁殖。特點：維持營養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應用范圍：實驗室科學研究第33頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共89頁，2024年2月25日，星期天恒濁器與恒化器的比較第35頁,共89頁，2024年2月25日，星期天溫度pH值氧三、理化因子對微生物生長的影響第36頁,共89頁，2024年2月25日，星期天溫度是影響微生物生長的最重要因素之一。溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)在：影響酶活性，溫度變化影響酶促反應速率，最終影響細胞合成。影響細胞膜的流動性，溫度高，流動性大，有利于物質(zhì)的運輸，溫度低，流動性降低，不利于物質(zhì)運輸，因此，溫度變化影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。影響物質(zhì)的溶解度，對生長有影響。（一）溫度溫度對微生物生長影響第37頁,共89頁，2024年2月25日，星期天最低生長溫度：低于此溫度，微生物不能生長繁殖最適生長溫度：微生物生長繁殖最快的溫度最高生長溫度：高于此溫度，不能生長繁殖致死溫度：10分鐘內(nèi)被完全殺死的最低溫度生長溫度的三基點第38頁,共89頁，2024年2月25日，星期天

根據(jù)微生物生長的最適溫度不同，可以將微生物分為嗜冷、兼性嗜冷、嗜溫、嗜熱和超嗜熱等五種不同的類型。它們都有各自的最低、最適和最高生長溫度范圍。

微生物類型

生長溫度／℃最低最適最高

嗜冷微生物0以下1520

兼性嗜冷微生物020-3035嗜溫微生物15-2020-4545以上嗜熱微生物4555-6580

超嗜熱或嗜高溫微生物6580-90100以上不同微生物對溫度要求不同第39頁,共89頁，2024年2月25日，星期天◆影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，進而影響對物質(zhì)的吸收能力?！舾淖兠富?、酶促反應的速率及代謝途徑：如：酵母菌在pH4.5-5產(chǎn)乙醇，在pH6.5以上產(chǎn)甘油、酸?！舡h(huán)境pH值還影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收，或有毒物質(zhì)的毒性。pH值對微生物生長的影響（二）pH值第40頁,共89頁，2024年2月25日，星期天微生物的生長pH值范圍極廣，從pH<2~>8都有微生物能生長，但是絕大多數(shù)種類都生活在pH5.0~9.0之間。微生物生長的pH值三基點：各種微生物都有其生長的最低、最適和最高pH值。不同的微生物最適生長的pH值不同，根據(jù)微生物生長的最適pH值，將微生物分為：

嗜堿微生物：硝化細菌、尿素分解菌、多數(shù)放線菌耐堿微生物：許多鏈霉菌中性微生物：絕大多數(shù)細菌，一部分真菌嗜酸微生物：硫桿菌屬耐酸微生物：乳酸桿菌、醋酸桿菌不同微生物對pH要求不同第41頁,共89頁，2024年2月25日，星期天同一種微生物在其不同的生長階段和不同的生理生化過程中，對pH值的要求也不同。在發(fā)酵工業(yè)中，控制pH值尤其重要。微生物 生長最適pH 合成抗生素最適pH灰色鏈霉菌 6.3~6.9 6.7~7.3紅霉素鏈霉菌 6.6~7.0 6.8~7.3產(chǎn)黃青霉 6.5~7.2 6.2~6.8金霉素鏈霉菌 6.1~6.6 5.9~6.3龜裂鏈霉菌 6.0~6.6 5.8~6.1灰黃青霉 6.4~7.0 6.2~6.5生長的最適pH值與發(fā)酵的最適pH值第42頁,共89頁，2024年2月25日，星期天同一種微生物在不同的生長階段和不同生理生化過程中，對環(huán)境pH值要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌在pH值=5.5-7.0時，以菌體生長為主在pH值=4.3-5.3時，進行丙酮丁醇發(fā)酵同一種微生物由于環(huán)境pH值不同，可能積累不同的代謝產(chǎn)物。例如：黑曲霉pH值=2—3時，產(chǎn)物以檸檬酸為主，只產(chǎn)少量草酸。pH值在7左右時，產(chǎn)物以草酸為主，只產(chǎn)少量檸檬酸。第43頁,共89頁，2024年2月25日，星期天微生物細胞內(nèi)的pH值微生物細胞內(nèi)的pH值穩(wěn)定，一般都接近中性。微生物胞內(nèi)酶的最適pH值一般為中性，胞外酶的最適pH值接近環(huán)境pH值。第44頁,共89頁，2024年2月25日，星期天微生物的生命活動對環(huán)境pH值的影響★微生物在生長過程中也會使外界環(huán)境的pH值發(fā)生改變，原因：由于有機物分解：分解糖類、脂肪等，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)液pH值下降；分解蛋白質(zhì)、尿素等，產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)液pH值上升由于無機鹽選擇性吸收：銨鹽吸收（(NH4)2SO4H2SO4），pH↓硝酸鹽吸收(NaNO3NaOH)，pH↑★培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH值的措施過酸時：加入堿或適量氮源，提高通氣量。過堿時：加入酸或適量碳源，降低通氣量。NH4+被吸收NO3+被吸收第45頁,共89頁，2024年2月25日，星期天微生物對氧的需要和耐受力在不同的類群中變化很大，根據(jù)微生物與氧的關(guān)系,可把它們分為幾種類群:

專性好氧菌:好氧菌微好氧菌：兼性厭氧菌耐氧厭氧菌：厭氧菌

(專性)厭氧菌：氧氣對微生物生長的影響（三）氧氣第46頁,共89頁，2024年2月25日，星期天專性好氧菌（strictaerobe）必須在有分子氧的條件下才能生長，有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，細胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxidedismutase）和過氧化氫酶。在有氧或無氧條件下均能生長，但有氧情況下生長得更好，在有氧時靠呼吸產(chǎn)能，無氧時接發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能；細胞含有SOD和過氧化氫酶。微好氧菌（microaerophilicbacteria）只能較低的氧分壓下才能正常生長，通過呼吸鏈并以氧為最終氫受體而產(chǎn)能。兼性厭氧菌（facultativeaerobe）第47頁,共89頁，2024年2月25日，星期天耐氧菌（aerotolerantanaerobe）可在分子氧存在下進行厭氧生活的厭氧菌。生活不需要氧，分子氧也對它無毒害。不具有呼吸鏈，依靠專性發(fā)酵獲得能量。細胞內(nèi)存在SOD和過氧化物酶，但缺乏過氧化氫酶。厭氧菌（anaerobe）分子氧對它有毒害，短期接觸空氣，也會抑制其生長甚至致死；在空氣或含有10%CO2的空氣中，在固體培養(yǎng)基表面上不能生長，只有在其深層的無氧或低氧化還原電勢的環(huán)境下才能生長；生命活動所需能量通過發(fā)酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵提供；細胞內(nèi)缺乏SOD和細胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶。第48頁,共89頁，2024年2月25日，星期天各類菌所含對氧解毒酶專性好氧菌SOD，過氧化氫酶兼性厭氧菌SOD，過氧化氫酶專性厭氧菌二種酶均無微好氧菌少量SOD耐氧菌SOD，過氧化物酶第49頁,共89頁，2024年2月25日，星期天在培養(yǎng)不同類型的微生物時，要采用相應的措施保證不同微生物的生長。培養(yǎng)好氧微生物：需震蕩或通氣，保證充足的氧氣。培養(yǎng)專性厭氧微生物：需排除環(huán)境中的氧氣，同時在培養(yǎng)基中添加還原劑，降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位勢。培養(yǎng)兼性厭氧或耐氧微生物：可深層靜止培養(yǎng)。第50頁,共89頁，2024年2月25日，星期天四、消毒與滅菌消毒(disinfection)：利用某種方法殺死或滅活物質(zhì)或物體中所有病原微生物的一種措施滅菌(sterilization)：指利用某種方法殺死物體中包括芽孢在內(nèi)的所有微生物的一種措施第51頁,共89頁，2024年2月25日，星期天溫度輻射作用過濾超聲波（一）物理方法第52頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1、溫度高溫處理是最常用的物理方法高溫可引起蛋白質(zhì)、核酸等活性大分子氧化或變性失活而導致微生物死亡。第53頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共89頁，2024年2月25日，星期天★干熱滅菌法（dryheatsterilization）火焰燒灼滅菌（焚燒法incineration）：是將被滅菌物品在火焰中燃燒，使所有的生物質(zhì)碳化。簡單、徹底，但對被滅菌物品的破壞極大。適用于無經(jīng)濟價值的物品滅菌，及不怕燒的實驗器具，如接種環(huán)、鑷子、試管或三角瓶口的滅菌等。烘箱熱空氣滅菌(干燥熱空氣滅菌hot-airoven)：將物品放入烘箱內(nèi)，然后升溫至150℃—160℃，維持1—2小時。適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌，不適合液體樣品，及棉花、紙張、纖維和橡膠類物質(zhì)的滅菌。特點：由于空氣傳熱穿透力差，菌體在脫水狀態(tài)下不易殺死，所以溫度高、時間長。

第55頁,共89頁，2024年2月25日，星期天★濕熱法(moistheatsterilization)：特點：時間短、滅菌效果高原因：飽和水蒸汽穿透力強；

濕熱易破壞細胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子的

穩(wěn)定性，主要破壞氫鍵結(jié)構(gòu)。第56頁,共89頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度的關(guān)系干熱和濕熱空氣穿透力的比較第57頁,共89頁，2024年2月25日，星期天干熱與濕熱空氣對不同細菌的致死時間比較第58頁,共89頁，2024年2月25日，星期天高壓蒸汽滅菌利用水的沸點隨水蒸氣壓力的增加而上升，以達到100℃以上高溫滅菌的方法。方法：121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2、0.105MPa

）維

持15-30min。

112℃（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。

115℃（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。應根據(jù)滅菌物品的性質(zhì)或成分選擇滅菌溫度例如：生理鹽水、營養(yǎng)瓊脂等培養(yǎng)基用121℃。含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培養(yǎng)基用112℃。適用：耐高溫物品，玻璃儀器、含水或不含水的物品。

第59頁,共89頁，2024年2月25日，星期天高壓蒸汽滅菌鍋注意事項：排凈冷空氣；滅菌終了，緩慢降壓；滅菌結(jié)束，趁熱取出物品。第60頁,共89頁，2024年2月25日，星期天常壓蒸汽滅菌（間歇滅菌）：

將待滅菌物品在80-100℃蒸煮15-60min，冷卻后擱置室溫（28-37℃）下過夜，并重復以上過程三遍以上。其蒸煮過程可殺死微生物的營養(yǎng)體，但不能殺死芽胞，室溫過夜促使殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，再經(jīng)蒸煮過程可殺死新的營養(yǎng)體；循環(huán)三次以上可保證徹底滅菌的目的。適用于不耐高溫的物品滅菌，如不適于高壓滅菌的特殊培養(yǎng)基、藥品的滅菌。缺點是麻煩、費時。第61頁,共89頁，2024年2月25日，星期天煮沸消毒將水加熱至100℃，煮沸15min—30min，可殺死所有營養(yǎng)細胞和部分芽孢，達到消毒物的目的。巴斯德消毒（Pasteurization）：用較低的溫度來殺死其中的病源微生物，這樣既保持食品的營養(yǎng)風味，又進行了消毒該法一般是將待消毒的液體食品置于62℃處理30min，然后迅速冷卻。即可達到消毒目的。低溫長時法：62.9℃,30min處理牛奶高溫瞬時法：71.6℃,15min處理牛奶超高溫巴斯德滅菌法：讓液體食品停留在140℃左右3-4s，急劇冷卻至75℃，經(jīng)勻質(zhì)化后冷卻至20℃。消毒第62頁,共89頁，2024年2月25日，星期天低溫是通過降低酶反應速度使微生物生長受到抑制。冷藏法：5℃，微生物斜面菌種放置冷藏箱中可保存數(shù)周至數(shù)月而不衰竭死亡；食品保鮮冷凍法：食品工業(yè)中采用-10℃左右的冷凍溫度較長時間地保藏食品；冷凍法也可用作菌種保藏，但所需溫度更低，如-80℃低溫冰箱、或-78℃干冰、或-80℃液氮中冷凍保存。（2）低溫第63頁,共89頁，2024年2月25日，星期天輻射：是能量通過空間傳遞的一種物理現(xiàn)象。與微生物有關(guān)的輻射：電磁輻射：可見光、紫外光，電離輻射：χ、γ、β射線。2、輻射第64頁,共89頁，2024年2月25日，星期天（1）電磁輻射：a.可見光：波長在400—800nm的電磁輻射為可見光。大部分微生物不需要光，少數(shù)菌需要光作為能源。一般來講，可見光對大多數(shù)化能微生物沒有影響，但是，太強或連續(xù)長時間照射也會導致微生物死亡（光氧化作用）。第65頁,共89頁，2024年2月25日，星期天b.紫外線（ＵＶ）波長在100—400nm的電磁輻射為紫外線。紫外線殺菌或誘變原理：紫外線作用于DNA

，使其產(chǎn)生胸腺嘧啶二聚體，引起DNA結(jié)構(gòu)變形，阻礙正常的堿基配對，從而造成微生物變異或死亡。紫外線會使空氣中的分子氧變成臭氧，臭氧釋放的原子氧有殺菌作用。其中波長在260—280nm處的紫外線殺菌力最強。主要因為核酸（DNA、RNA）的吸收峰為260nm，蛋白質(zhì)的吸收峰為280nm。第66頁,共89頁，2024年2月25日，星期天光復活現(xiàn)象：經(jīng)紫外線照射的微生物，在可見光下，光可以激活DNA修復酶，該酶能修復DNA上的損傷，使微生物的突變率或死亡率下降。微生物對紫外線的抵抗力與以下因素有關(guān)：照射時間：照射時間長，死亡率高。照射強度：照射強度大，死亡率高。微生物種類及生長階段：革蘭氏陽性菌比陰性菌抗性強；多倍體比單倍體抗性強；孢子和芽孢比營養(yǎng)細胞抗性強；干燥細胞比濕潤細胞抗性強。應用：由于穿透力差，只適用于物體表面以及空氣、水的消毒殺菌，也用于誘變育種。第67頁,共89頁，2024年2月25日，星期天(2)電離輻射：χ、γ、β射線，波長短，能量高，有較強的殺傷力。作用原理：可引起水和其他物質(zhì)的電離，產(chǎn)生游離基，使核酸、蛋白質(zhì)或酶發(fā)生變化，造成細胞損傷或死亡。特點：穿透力強，非專一性，作用于一切細胞成分，對所有生物均有殺傷作用。應用：用于殺菌或菌種誘變。第68頁,共89頁，2024年2月25日，星期天采用濾孔比細菌還小的篩子或濾膜作成各種過濾器，當空氣或液體流經(jīng)篩子或濾膜時，微生物不能通過濾孔而被阻留在一側(cè)，從而達到滅菌的目的。但不能除去病毒。濾器孔徑：常用0.22μm

、0.45μm

。應用：對于含酶、血清、維生素和氨基酸等熱敏物質(zhì)除菌。3、過濾除菌第69頁,共89頁，2024年2月25日，星期天超聲波：每秒鐘振動在1600以上的聲波。機理：引起膜破壞，細胞破裂，內(nèi)涵物逸出。

應用：破碎細胞，提取胞內(nèi)物質(zhì)（代謝產(chǎn)物、酶等）殺菌,超聲波殺菌效力大小與頻率、強度、處理時間等多種因素有關(guān)。4、超聲波第70頁,共89頁，2024年2月25日，星期天消毒劑:可以抑制或殺滅微生物，但對人體也可能產(chǎn)生有害作用的化學試劑.——主要用于抑制或殺滅物體表面、器械、排泄物和環(huán)境中的微生物。防腐劑:可以抑制或阻止微生物生長，但對人體或動物體的毒性較低的化學藥劑.——用于肌體表面，如皮膚、粘膜、傷口等處防止感染，也有的用于食品、飲料藥品的防腐作用?！畹F(xiàn)今消毒劑和防腐劑間的界限已并不很嚴格.☆消毒防腐劑的作用機理一般有下列三種方式:①使微生物蛋白質(zhì)凝固變性,發(fā)生沉淀.如酒精等.②破壞菌體的酶系統(tǒng),影響菌體代謝.如過氧化氫等.③降低微生物表面張力,增加細胞膜的通透性,使細胞發(fā)生破裂或溶解.如來蘇兒等酚類物質(zhì).（二）化學方法第71頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1、酸和堿前面講過微生物細胞中的DNA，RNA，Pr，E只有在中性條件下才能體現(xiàn)活性，因此強酸堿具殺菌作用。醫(yī)院病房常用乙酸消毒?；瘜W方法的控制第72頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2、重金屬及其鹽類是殺菌劑和防腐劑，作用最強的是Hg,Ag,Cu,作用機理：使蛋白質(zhì)變性，使酶失活。（與E的－SH結(jié)合。）0·02－0·2％HgCl2（升汞）溶液對大多數(shù)細菌有致死作用。CuSO4對真菌、藻類有強殺傷力，波爾多（CuSO4＋堿）防植物病害。另外還有砷，鉍、銻的化合物是治療梅毒的特效藥。0·1－1％AgNO3

可消毒皮膚，1％濃度新生兒點眼預防眼炎第73頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3、有機化合物甲醛：純甲醛為氣體，37－40％水液為福爾馬林。醇是脫水劑蛋白質(zhì)變性劑,70％乙醇殺菌效果最好。酚：3－5％的石碳酸溶液幾分鐘即可致死細菌甲酚殺菌力最強，煤酚皂液（來蘇爾）為甲酚和肥皂的混合液。第74頁,共89頁，2024年2月25日，星期天4、氧化劑K2MnO4使菌體蛋白質(zhì)氧化，使酶失活。

0·1－3％濃度可用于皮膚，果品、餐具、消毒。H2O2清洗傷口。第75頁,共89頁，2024年2月25日，星期天酪AA+I2→二碘酪氨酸5、鹵素

碘殺菌力強，3－7％碘溶于70－83％的乙醇中成碘酒。

氯及氯化物常用于水及食品消毒與水結(jié)合放出原子氧（O）用