十足目虹彩病毒1檢測(cè) 熒光定量PCR法

1十足目虹彩病毒1檢測(cè)熒光定量PCR法本文件描述了十足目虹彩病毒1熒光定量PCR檢測(cè)法的試劑與材料、儀器設(shè)備、操作方法及結(jié)果判定。本文件適用于十足目虹彩病毒1的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法SC/T7103水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范3試劑與材料3.1一般要求本文件所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純?cè)噭?；試?yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682一級(jí)水的要求。3.2引物與TaqMan-MGB探針上游引物DIV1-qF1、下游引物DIV1-qR1、TaqMan-MGB探針DIV1-qP1根據(jù)表1給出的寡核苷酸序列人工合成，擴(kuò)增167bp的目的片段。使用濃度均為10μmol/L。使用前按本標(biāo)準(zhǔn)要求先用滅菌DEPC水稀釋?zhuān)♂尯蠓盅b成小量置于-20℃保存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融。表1特異性引物及探針寡核苷酸序列及擴(kuò)增的目的片段大小FAM-CCATAGGCACCGCAA3.3DNA抽提試劑3.3.1商品化DNA抽提試劑盒。3.3.2異丙醇。3.3.3無(wú)水乙醇。3.3.4熒光定量PCR試劑。3.3.52×PremixExTaq?(ProbeqPCR)。3.3.6ROXReferenceDye或ROXReferenceDyeⅡ：參考儀器使用說(shuō)明，用以校正孔間熒光信號(hào)誤差。3.3.7工作標(biāo)準(zhǔn)品為pMD18-T-MCPDIV1：可委托生物公司制備，使用濃度為1.0×104拷貝/μL～1.0×107拷貝/μL。3.3.8陽(yáng)性對(duì)照為已知DIV1陽(yáng)性的對(duì)蝦組織，-80℃保存。3.3.9陰性對(duì)照為已知DIV1陰性的對(duì)蝦組織，-80℃保存。3.3.10空白對(duì)照以無(wú)菌雙蒸水為模板。24儀器設(shè)備及耗材4.1儀器設(shè)備4.1.1定量PCR儀。4.1.2高壓滅菌鍋。4.1.3組織勻漿機(jī)。4.1.4普通冰箱：具冷藏箱，可達(dá)到-18℃以下冷凍箱體。4.1.5超低溫冷藏設(shè)備：可達(dá)到-80℃。4.1.6水浴鍋或金屬浴。4.1.7臺(tái)式高速離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速能達(dá)12000r/min以上。4.1.8旋渦振蕩器。4.1.9微量離心機(jī)。4.1.10微量移液器。4.2耗材4.2.1微量移液器槍頭。4.2.21.5mL微量離心管：經(jīng)高壓蒸汽滅菌，一次性使用。4.2.3滅菌0.2mLPCR管：經(jīng)高壓蒸汽滅菌，一次性使用。4.2.4塑料或乳膠手套：一次性使用。5操作方法5.1采樣樣品采集按SC/T7103的規(guī)定執(zhí)行。5.2樣品前處理蝦樣按不同規(guī)格取不同組織。其中，受精卵、幼體、仔蝦采集整條蝦作為樣品，3cm以下幼蝦采集除蝦眼外整條蝦作為樣品，3cm以上蝦采集鰓、肝胰腺作為樣品。采集的樣品用組織勻漿機(jī)勻漿，立即進(jìn)行DNA提取操作或-80℃超低溫冰箱保存。5.3陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品的處理陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品的采集和取樣分別按6.1和6.2進(jìn)行，將采集的蝦組織樣品勻漿后小量（30mg）分裝于1.5mL離心管后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ看螜z測(cè)前各取出1管陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照樣品，與待檢樣品進(jìn)行下面的操作。5.4DNA的提取取5.2中30mg樣品，按照商品化動(dòng)物組織基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總DNA，最后加60μL洗脫緩沖液溶解DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.5熒光定量PCR采用50μL反應(yīng)體系。在熒光定量PCR管中依次加入滅菌DEPC水13.5μL，2×PremixExTaq?(ProbeqPCR)25μL，ROXReferenceDyeⅡ0.5μL，上游引物DIV1-qF1、下游引物DIV1-qR1、探針DIV1-qP1各2μL，模板5μL。加完試劑后瞬時(shí)離心，將PCR反應(yīng)管置于定量PCR擴(kuò)增儀內(nèi)，按下面反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火并延伸45s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；在60℃結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。6結(jié)果判定6.1定性檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于35且出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照和空白對(duì)照Ct值不顯示且未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)有效；若檢測(cè)樣品的Ct值小于或等于35，且有擴(kuò)增曲線，則判為DIV1DNA陽(yáng)性；Ct值大于35，且有擴(kuò)3增曲線，則重復(fù)1次，如結(jié)果一致，判為DIV1DNA陽(yáng)性；Ct值大于35，重復(fù)結(jié)果未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判為DIV1DNA陰性。6.2定量檢測(cè)6.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)小于或等于-0.970，陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于35且出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照和空白對(duì)照Ct值不顯示且未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)有效。6.2.2檢測(cè)樣本中1×103拷貝/mg≤DIV1DNA≤1×108拷貝/mg，測(cè)定結(jié)果有效，可直接報(bào)告陽(yáng)性及相應(yīng)的拷貝量。6.2.3檢測(cè)樣本中DIV1DNA＞1×108拷貝/mg，即可直接報(bào)告為＞1×108拷貝/mg，也可用滅菌DEPC水10倍梯度做相應(yīng)稀釋?zhuān)蛊淇截惲柯湓?×105拷貝/mg～1×107拷貝/mg范圍內(nèi)再重新測(cè)定，測(cè)定結(jié)果應(yīng)以稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正。6.2.4檢測(cè)樣本DIV1DNA的拷貝量為10拷貝/mg～1×103拷貝/mg時(shí)，建議對(duì)該樣本進(jìn)行雙份重試，如雙份樣本重試結(jié)果仍在10拷貝/mg～1×103拷貝/mg，則按實(shí)際值計(jì)算；如雙份或一份重試結(jié)果＜10拷貝/mg，則判為DIV1DNA陰性。6.2.5Ct值不顯示時(shí)或DIV1DNA的拷貝量＜10拷貝/mg，該樣本判為DIV1DNA為陰性。4（規(guī)范性）DIV1熒光定量PCR特異性引物及探針序列和檢測(cè)結(jié)果圖示A.1DIV1MCP基因序列及特異性引物和探針圖示ATGTTGAGATTTATTTATGAAAAAAAAATCTTGTTAATAAAAAATTGTAAAATGGCTAATATTGCAGGAGCTCTACAAGATATGGCTAATCTAGGGGCGGTTGAAAGGTACCAGTACGGAACCACCAACGCCGTCACTTATTTTATTCGTGAAACGAGAAAGTCTACATTGTTTTCTCAACTCCCAATTCAACTCTCATCTAAAAATGGAAATCCCGATTTCGATCGTGAATGGTCTGTAGAACCAAGTAAGGCGTTCGATTATCTGATCCATATGTGGATCCGGGTTACCGTTCCCGAAGTTAAACTTTTGGCGGGTAATGTATATAAGGAGCACGGTCGAATTCGCTGGACCCGAAACTTTATGCACAATCTTATCAAGAAGGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCGAGATTGAAAAGTTTGACAACTATTTCCTCGATTTCTGGAACCAATTTACTCTGTCCTCTTCAAAGAAGGATGGATACAACAACATGATTGGAAACGATGATGATCTTCTGATCCCAAAATCCAAGGATGGAAAGATTGAATCAAAGAGTCTTACACTTCCTATCCCCTTCTTCTTTTCTCGTGATTCTGGTTTGGCTCTCCCAGTCGGTGGTGTCAAGTGGAACAAGCTCAGGATTGATTTCGAATTCAGGAACTGGACAGAGCTTCTGATTCTTGAAAATGTTGGTGCGGCCCACAATGGAGAGAAAAATCCATGCAAGGTTCCTCAGGTTGGAAGTGATATCGCCGTTGCCCCCTCACTGTCAAATGTGCAATGTTGGGTGAATGGTGGTCTTATCCCCGAAGCCGAGCGAGCACGTATGGGATGTGTTCACCGCGACATGTTGATTGAATCTATCCAGACTTCTTCCAAGCTCAACTTTAACCCCGTCCTCAACCCAAATCCCTCTTACGACATCAGGTTCCAGAGAACTGTAAAGGCTCTCTTCTTCGGTGTCAGGAACACTACCAATCCAAATGTTTGGTCCAATTACACAACCGCATCACCCGTACCCGACGCCGACAAGATTGATTTCGACCCAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGCAAACATTAGATACGAATCTTCAGATCGTATTCCCGTGATGACTGCCGATTACTTCTCACTGATCGAACCCTACTACAAGGCACCGGCCATTCCCGAACTCACCGGATACCACATGTTCTCTTACGCTCTCAAGATGAACAATGTTGATCCTTCTGGGTCTGCCAATTACAGCATCCTGAACAATGTGAGTATCCAACTTCAATGCTCCGAAGCTGCTATTAAAGCGGCAAAG