梅迪-維斯納病瓊脂凝膠免疫擴散試驗方法

中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準梅迪-維斯納病瓊脂凝膠免疫擴散2002-08-27發(fā)布2002-12-01實施中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布梅迪-維斯納(Maedi-Visna)病是羊的慢性致死性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織[WorldOrganizationforAnimalHealth(英),OfficeIntentionaldesEpizootic(法),OIE]將之列為B類、我國將其列為二類動物疫病。梅迪-維斯納病(Visna-Maedi)又稱綿羊進行性肺炎、進行性間質(zhì)性肺炎等，是在臨床和病理學上明顯不同的兩種慢性進行性傳染病。這兩種病的潛伏期均長達數(shù)月至數(shù)年，病程長，發(fā)展緩慢，均以死亡而20%～30%。維斯納病以慢性脫髓鞘的亞急性腦炎為特征，病羊口唇震顫，頭部姿勢異常，后肢麻痹，隨后發(fā)展為截癱病，全身麻痹，羊群病死率為6%～10%。盡管梅迪病和維斯納病在臨床癥狀和病理變化上有很大差別，但病毒學、血清學、分子生物學和動物試驗都證明，這兩種病的病原是同一種病毒，即梅迪-維斯納病毒。1923年在加拿大蒙大拿綿羊中首先發(fā)現(xiàn)梅迪病，1933年在冰島綿羊中大流行，其后發(fā)秘魯?shù)葒偷貐^(qū)。我國60年代也曾發(fā)現(xiàn)可疑病例，其臨床癥狀和剖檢變化與梅迪病相似。1984年從澳大利亞和新西蘭引進的邊區(qū)萊斯特綿羊及其后代檢出了抗體，并于1985年分離出病毒。該病既無疫苗可供預防，又無本標準是根據(jù)OIE《診斷試驗和生物試劑標準手冊》(2000年版)(ManualofStandardsforDiag-nosticTestsandVaccines,2000)第2.4.4/5章所規(guī)定的“瓊脂免疫擴散試驗(國際貿(mào)易指定試驗)”和本國的多年實驗研究及實踐制定的，但進行了以下修改：試驗的孔徑和孔距稍有不同，不影響試驗結果且更易于操作和觀察。本標準的附錄A為規(guī)范性附錄。本標準由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。本標準由全國動物檢疫標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。1梅迪-維斯納病瓊脂凝膠免疫擴散本標準規(guī)定了梅迪-維斯納病瓊脂凝膠免疫擴散試驗的技術要求。本標準適用于梅迪-維斯納病感染的檢測、診斷和流行病學調(diào)查。2瓊脂免疫凝膠擴散試驗2.1材料準備2.1.1瓊脂板，制備方法見附錄A(規(guī)范性附錄)。2.1.2抗原，標準陽性血清、陰性血清。2.2操作方法2.2.1瓊脂平皿，制備、打孔見附錄A。2.2.2吸取抗原滴加中心孔，加滿為止。2.2.3吸取標準陽性血清分別滴加外周2、4、6孔，加滿為止。每一試驗應包括一弱陽性對照。2.2.4吸取被檢血清分別滴加外周1、3、5孔，加滿為止。2.3判定2.3.1抗原、標準陽性血清和被檢血清滴加完畢后，將平皿倒置，放濕盒內(nèi)置37℃下孵育，并于24h及48h觀察是否有沉淀線出現(xiàn)。2.3.2當標準陽性血清與抗原孔間有明顯沉淀線，而被檢血清與抗原孔間也有明顯沉淀線，并與標準陽性血清的沉淀線相融合，或標準陽性血清與抗原孔的沉淀線末端明顯在毗鄰的被檢血清孔處向中央孔方向偏彎時，該被檢血清為陽性(+)。當標準陽性血清與抗原孔間有明顯沉淀線，而被檢血清與抗原孔間無沉淀線，或標準陽性血清與抗原孔間沉淀線末端向毗鄰的被檢血清孔直伸或向該孔偏彎時，該被檢血清為陰性(一)。介于陰、陽性之間為可疑(士)?？梢蓱貦z，仍為可疑判為陽性(+)。2(規(guī)范性附錄)A.1三羥甲基氨基甲烷(Tris)瓊脂板制備以pH8.0含8%氯化鈉的0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液，配制1%瓊脂糖，煮沸溶化后濾去沉淀，加0.01%硫柳汞，倒成2mm～2.5mm厚瓊脂板，待凝固后用打孔