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文檔簡介

葡萄苦腐病菌檢疫鑒定方法(規(guī)范性附錄)分子生物學(xué)鑒定B.1DNA提取方法樣本為植物組織時，將植物組織洗凈消毒后切成小塊，冷凍加液氮研磨，放入1.5mL.離心管中待用。樣本為真菌時，收集菌絲放入1.5mL.浸在液氮里的離心管中，用塑料杵碾碎待用。離心管加入300μl～500μL.CTAB緩沖液(其中含0.1g蛋白醇K)混勻，65℃水浴1h;13000g離心5min～10min,保留上清液；加500pl.Tris飽和酚：三氯甲烷：異戊醇(體積為25:24:1)混勻，13000g離心5min~10min,保留上清液；再加500yl.13000g離心5min～10min.保留上清液；加入1mL異丙醇混勻，-70℃下放置1h.或-20℃過夜；13000g離心30min,可見DNA沉淀；70%乙醇洗DNA沉淀，室溫干燥；用30pL~50μLTrisEDTA緩沖液溶解DNA,待用。特異性引物GUA-1序列為5'-GTGGCCCTGTAAACTCTTGT-3',GUA-2序列為5'-GGC-25pl.反應(yīng)體系中含：樣品DNA1pL(1ng~50ng)。10×PCRbuffer2pL.2.5mmol/LdNTps2pl.10μmol/L.Primers0.5pL/0.5pL.5U/gl.TagDNAp0.2pL.ddH?O16.3pL。同時要設(shè)置陰性對照，以Tris-EDTA緩沖液代替DNA樣品。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性，94℃5min→變性，94℃1min.退火53℃30s,72℃45s,35個循環(huán)→PCR產(chǎn)物的檢測在1XTAE電泳緩沖液中，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm,0.5%EB染色20min,凝膠成像儀分析結(jié)果。B.3實時黃光PCR檢測實時熒光PCR引物序列為GUA-P1:TCGCGGCTGGAGAAGG,GUA-P2:TCGATGCCAGAAC-CAAGAGAT,TagMan探針GUA-Probe-117:5°-FAM-TGCCGGTGGCCCTGTAAACTCTTGT-TAMRA-3'。探針5'端標(biāo)記的英光報告基團為FAM,3”端標(biāo)記的熒光猝滅基團為TAMRA。25pL反應(yīng)體系中含；樣品DNA1pl,10×PCRbuffer2.5pl,25mmol/L氯化鎂2μL.2.5mmol/LdNTps2pl.,10pmol/L.PrimersIyL/1yL.,10gmel/L探針Probe-1TagDNApolymeras

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