總RNA的提取電泳鑒定及RTPCR

關(guān)于總RNA的提取電泳鑒定及RTPCR實(shí)驗(yàn)一.提取小鼠肝臟組織的RNA第2頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、真核細(xì)胞的總RNA1、mRNA:1-5%5`鳥(niǎo)嘌呤7位甲基化—CH3修飾。

1）免受核酸酶破壞，

2）起始、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。

3`poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)20--200個(gè)A.翻譯所必需。起始密碼：AUG

終止密碼：UAA,UAG,UGA。

2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%

大亞基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt

小亞基40S:18S=1874nt第3頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、RNA提取的注意事項(xiàng)

RNA酶：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實(shí)驗(yàn)器材表面。生物活性非常穩(wěn)定：耐熱、耐酸、耐堿。

1、盡量避免外源性RNase污染

A.操作環(huán)境空氣潔凈。帶手套、口罩。

B.用新開(kāi)封的化學(xué)試劑。（試劑應(yīng)該專(zhuān)用）

C.

一次性塑料器材最好是新開(kāi)封，

(DEPC水處理后）高壓滅菌。

D.玻璃器材、水都應(yīng)該經(jīng)過(guò)去RNase處理。對(duì)玻璃器材還應(yīng)該進(jìn)行高溫烘烤。

2、抑制內(nèi)源性RNase活性：RNase抑制劑。

RNA分離的關(guān)鍵因素：避免RNA酶的污染。第4頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天1)發(fā)放口罩，帽子，每個(gè)組來(lái)一個(gè)人領(lǐng)取。

將1mLTrizol試劑移入Eppendorf管中。2)實(shí)驗(yàn)教師操作:

取新鮮小鼠肝臟組織，組織塊不宜過(guò)大,

放在玻片上立即研磨,研磨要徹底。3)將研磨后的組織(小米粒大小)轉(zhuǎn)移至1mLTrizol試劑中，蓋緊蓋，上下顛倒混合2min以上。

使組織細(xì)胞充分裂解。肉眼觀察可見(jiàn)液體變成均勻渾濁狀。4)室溫孵育10min。三、RNA提取的實(shí)驗(yàn)操作

播放有聲課件1:RNA提取方法及注意事項(xiàng)第5頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、異硫氰酸胍法：

GuSCN是一種強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，能夠裂解細(xì)胞的同時(shí)，還能有效地抑制內(nèi)源性Rnase的活性，通過(guò)有機(jī)溶劑的分步抽提，可獲得純度較高的細(xì)胞總RNA。特點(diǎn)：需低溫操作，但價(jià)格經(jīng)濟(jì)。2、Trizol試劑（商品化產(chǎn)品）特點(diǎn)：在室溫下可以提取細(xì)胞總RNA，簡(jiǎn)單、快速、提取量大、純度高。3、mRNA提取試劑盒真核細(xì)胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚dT纖維素結(jié)合mRNA，將其從細(xì)胞總RNA中分離出來(lái)。RNA提取的幾種方法室溫孵育10min介紹第6頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天RNase抑制劑1、DEPC(二乙基焦炭酸鹽)

最常用的RNase抑制劑:與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。

有效濃度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室溫磁力攪拌20分鐘。用于浸泡各種器材。滅活條件：高壓。在Tris溶液中半衰期為1.25min。試劑的配制:無(wú)RNase的溶液(用DEPC水配制,高壓)

儲(chǔ)存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4

C，或液氮中。2、肝素：使用濃度：0.1—10mg/ml

效果:37

C時(shí)，可抑制95%的RNase活力。如果與DEPC聯(lián)合應(yīng)用，具有極強(qiáng)的抑制效果。第7頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天5)加入200

l氯仿，震蕩混勻20-30s，室溫放置5min（此期間液體開(kāi)始分層，不要輕易攪動(dòng)液體）。6)10000rpm，離心5minRNA(清澈透明)DNAProtein7)將清澈透明的上層水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中。有聲課件2:RNA干燥及溶解技巧第8頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天8)沉淀RNA：加0.5ml異丙醇，上下顛倒混勻，室溫10min。

10,000

rpm，4

C，離心10min．棄上清。９)加1ml75%乙醇洗滌管壁。

(注意貼管壁在沉淀的對(duì)側(cè)緩慢加入，不要攪動(dòng)沉淀)10)7500rpm，4

C離心1min，棄上清．再離心幾秒鐘，將管壁液體（用加樣器）完全移凈。用TriZol試劑提取總RNA時(shí)，全程均在室溫進(jìn)行。當(dāng)RNA沉淀用水溶解后，應(yīng)該注意在冰上操作，操作要迅速。第9頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天11)室溫干燥3－5min

（根據(jù)RNA沉淀大小決定，干燥后的沉淀應(yīng)該是無(wú)色膠樣透明狀，避免過(guò)分干燥,此步驟非常關(guān)鍵。）注意事項(xiàng)：RNA:避免放在37

C孵箱中過(guò)度干燥以防無(wú)法溶解。

RNA沉淀必須絕對(duì)干燥，微量乙醇?xì)埩?，容易造成RT的失敗，但過(guò)分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因。判斷RNA沉淀是否充分干燥但又不是過(guò)分干燥是逆轉(zhuǎn)錄成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。RNApellet：透明膠樣干燥后應(yīng)該無(wú)色透明第10頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天12）RNA的溶解：用加樣器吸取冰冷DEPC-H2O13.5

l，加到RNA上，進(jìn)行吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA應(yīng)置冰上保存。13)吸出4.5

l溶液放到冰上備用(將用于電泳).14)剩余9

l溶液,放到冰上備用（將用于RT－PCR）.注意：

RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加樣器反復(fù)多次吹打方可。但由于溶液體積非常小，要避免出現(xiàn)氣泡影響RNA的溶解。避免氣泡的方法：用加樣器的第一擋每次吹打都不要打出氣體判斷溶解程度：吹打時(shí)液體流動(dòng)不拐彎為止。第11頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)二.RNA的瓊脂糖凝膠電泳第12頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天

基本過(guò)程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對(duì)RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對(duì)RNA酶有抑制作用DEPC水來(lái)配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對(duì)樣品的降解RNA的瓊脂糖凝膠電泳第13頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天

RNA樣品：4.5

l

上樣緩沖液：1

l

混勻后，5.5

l直接電泳上樣（100伏，10－30分鐘）上樣前預(yù)電泳5min。

注意:電泳槽的清潔！所有試劑、器材、溶液需要滅RNA酶處理。

瓊脂糖凝膠要新鮮配制！紫外透射儀觀察電泳結(jié)果RNA的電泳上樣：第14頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天RNA電泳結(jié)果rRNA可以作為內(nèi)部Marker分子，通過(guò)觀察rRNA的兩條帶（28S和18S）的比例，可以判斷所提取mRNA是否存在降解。

RNA電泳并不能判斷mRNA是否提取成功，也不作為鑒定RNA提取質(zhì)量的常規(guī)方法，因?yàn)樵陔娪具^(guò)程中RNA可能發(fā)生降解。第15頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天

分析本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果：28S、18S和5S的比例。RNA電泳結(jié)果分析第16頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)三：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR（RT-PCR)第17頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天逆轉(zhuǎn)錄酶：存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)。常見(jiàn)有哺乳動(dòng)物型37oC，禽類(lèi)型42oC。以mRNA為模板的DNA聚合酶，形成與RNA堿基相互補(bǔ)DNA鏈，后者稱(chēng)為互補(bǔ)DNA－cDNA。

RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA雜合鏈上的RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)原理AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-5

68-70oC,annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-5

37-42oC,RTasemRNAmRNAcDNA10min1-2h

逆轉(zhuǎn)錄有聲課件3:RT的原理和注意事項(xiàng)第18頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天總RNA9lOligodT(0.05

g/ml)1

l(終：2.5ng/ml)

輕彈管底混合，置65℃水浴10min，

立即冰浴2min（防止RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)）。第一步：打開(kāi)RNA鏈之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使OligodT特異性地結(jié)合到PolyA尾。第19頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天

5

RT-buffer4

lRNasin(RNA酶抑制劑，40U/ml)1

ldNTPs(10mmol/L)4

lAMV（逆轉(zhuǎn)錄酶）1

l輕彈管底混合。置42oC水浴1h。第二步：向上述反應(yīng)溶液中依次加入下列試劑第三步：將上述反應(yīng)移至68oC水浴10min以滅活RTase，并冰浴，保存?zhèn)溆玫?0頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天午休第21頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天—PCR反應(yīng)體系的建立—PCR反應(yīng)的進(jìn)行—PCR產(chǎn)物的電泳—結(jié)果觀察與分析—PCR產(chǎn)物回收實(shí)驗(yàn)操作內(nèi)容

有聲課件（1）：

PCR的基本原理及反應(yīng)體系的組成PCR反應(yīng)動(dòng)畫(huà)目的基因片斷的體外擴(kuò)增（2）：PCR反應(yīng)條件的確定及PCR常見(jiàn)問(wèn)題的解決方案第22頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天1）模板DNA(上次課逆轉(zhuǎn)錄的cDNA）4l2）加入下列試劑,，順序可以改變

10XPCRbuffer(含MgCl2)5

ldNTPs(10mM)1

l3’引物(10

mol/L)1

l5’引物(10

mol/L)1

l3）加去離子水，補(bǔ)足50l最終反應(yīng)體系4）TaqDNA聚合酶(2U/

l)1

l實(shí)驗(yàn)操作一、建立PCR反應(yīng)體系3.輕彈管底混勻，然后放入離心機(jī)的套管內(nèi)，用離心機(jī)甩一下；4.將PCR小管交給老師，老師統(tǒng)一將樣品放入PCR儀。取1支200

l微量離心管（在第一組同學(xué)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方的平皿里）中，用Marker筆在管的側(cè)面標(biāo)記；2.依次加入下列試劑：第23頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天注意：（1）PCR相關(guān)試劑均放在每排實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方中間位置處的藍(lán)色圓盒中

（2）加樣的體積要準(zhǔn)確，1

l的體積不應(yīng)該超過(guò)白色槍頭的第一個(gè)格。

第24頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)操作二、PCR反應(yīng)的進(jìn)行1、將樣品放入PCR儀中2.PCR反應(yīng)條件

94℃

30SDNA變性(Denaturation)55℃30S退火(Annealing)72℃45S延伸(Extension)

上述溫度變化進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(cycles)。

72℃10min(Furtherextension)。

3.將同學(xué)們分成三組，分別觀察PCR的溫度循環(huán)。

其它同學(xué)課間休息。第25頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天播放：有聲課件（PCR講解1）播放：有聲課件（PCR講解2）播放：PCR動(dòng)畫(huà)第26頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)操作三、PCR產(chǎn)物的電泳1.教師指導(dǎo)學(xué)生將瓊脂糖凝膠（1%）放入膠床上。2.樣品制備：

在50lPCR產(chǎn)物中，加入6ul上樣液，混勻。

（上樣液：10×Loadingbuffer或6×Loadingbuffer）