NSE單抗的制備及雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立的開(kāi)題報(bào)告

NSE單抗的制備及雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立的開(kāi)題報(bào)告一、選題背景及意義NSE（neuron-specificenolase，神經(jīng)元特異抗原酶）是一種神經(jīng)元特異性糖酵解酶，其主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的細(xì)胞以及部分末梢組織中。近年來(lái)的研究表明，血清中NSE的變化與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和腦損傷有關(guān)。因此，NSE的檢測(cè)已成為診斷和預(yù)后評(píng)估這些疾病的重要指標(biāo)。目前對(duì)于NSE的檢測(cè)方法主要分為免疫學(xué)方法和生物化學(xué)方法。其中，免疫學(xué)方法具有高度的特異性和靈敏性，已成為NSE檢測(cè)的主要方法之一。而ELISA作為一種靈敏度和特異性都較高的免疫學(xué)檢測(cè)方法，已被廣泛應(yīng)用于NSE的檢測(cè)。雙抗夾心ELISA作為一種常見(jiàn)的ELISA方法，其具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)，因此也被廣泛應(yīng)用于NSE的檢測(cè)。二、研究目的和內(nèi)容本研究旨在建立NSE單抗的制備方法和雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，以提高NSE檢測(cè)的靈敏度和特異性，并為臨床NSE檢測(cè)提供一定的幫助。本研究的具體內(nèi)容包括：1.NSE單抗的制備：通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳將NSE純化，然后制備出與其特異結(jié)合的單克隆抗體；2.NSE與單抗的偶聯(lián)反應(yīng)和雙抗夾心ELISA的建立：通過(guò)對(duì)不同濃度的NSE和單抗進(jìn)行配對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)，建立出雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法；3.比較分析：比較本研究所建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法和傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)方法在NSE檢測(cè)方面的差異。三、研究意義1.建立NSE單抗的制備方法和雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，可以提高NSE檢測(cè)的靈敏度和特異性，提高臨床NSE檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性；2.本研究所建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)，不僅可以應(yīng)用于臨床NSE的檢測(cè)，還可為其他蛋白質(zhì)的檢測(cè)提供一定的參考。四、研究方法1.制備NSE單抗：（1）用75%乙醇消毒小鼠尾靜脈，麻醉后采集血液。（2）離心采集的血液，貫通卡內(nèi)可以對(duì)血液作防藍(lán)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照孔，移植瘤細(xì)胞和CD4+細(xì)胞。（3）制備包被抗原（NSE）：用純化的NSE制備出包被抗原。（4）腹腔注射BALB/c小鼠。（5）脾臟分離及維持。（6）純化和固定小鼠B細(xì)胞。（7）小鼠B細(xì)胞與包被抗原的混合，產(chǎn)生雜交瘤，選出與NSE特異性結(jié)合的單克隆抗體。2.雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法建立：（1）將罐蓋上寫(xiě)有A、B等字母的孔板卡放在移液器上。（2）先用三個(gè)開(kāi)口在中間縫紉機(jī)穿孔工具制成的三個(gè)不同直徑圓片的濾紙吸光度計(jì)95μl的酶標(biāo)試劑（Tween-20,Na2HPO4,H3PO4,NaCl,BSA和酶標(biāo)抗體）加入相應(yīng)孔中進(jìn)行孵育1小時(shí)。（3）在洗滌盤(pán)上加入洗滌液，將孔板中酶標(biāo)試劑溶液排出，利用洗滌液進(jìn)行洗滌操作。（4）將樣品（50μl）和89%Tween-20的洗滌液（50μl）混合，加入到孔中，孵育1小時(shí)后排出，利用洗滌液進(jìn)行洗滌操作。（5）加入與酶標(biāo)抗體結(jié)合的與酶標(biāo)試劑相同的多價(jià)抗體（100μl），孵育1小時(shí)后排出，利用洗滌液進(jìn)行洗滌操作。（6）向每孔加入底物B（50μl），孵育（20-30分鐘）放置5-10分鐘后，加入中止液（50μl）。（7）使用光譜計(jì)讀取酶標(biāo)板中的吸光度數(shù)據(jù)，計(jì)算出每個(gè)樣品中NSE的濃度。五、研究時(shí)間安排