核酸的分離與純化技術(shù)

第三章核酸的分離純化技術(shù)臨床樣本處理與分離純化技術(shù)1臨床樣本的處理2DNA的分離與純化3RNA的分離與純化4自動化分離純化系統(tǒng)第一節(jié)臨床樣本的處理核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3’,5’—磷酸二酯鍵連接成的一類生物大分子，包括核糖核酸RNA和脫氧核糖核酸DNA兩類。真核生物原核生物染色體DNA（細胞核內(nèi)，雙鏈線狀）細胞器DNA（線粒體或葉綠體，雙鏈環(huán)狀）染色體DNA

（雙鏈環(huán)狀）質(zhì)粒DNA一、臨床樣本處理的一般原則（一）樣本的采集生理活性物質(zhì)容易失活與降解，采集時要保持取材的新鮮，防止腐敗、變質(zhì)與微生物的污染，按照所需樣本的取材時間進行采集，根據(jù)不同類型的疾病、病程的不同階段以及檢測方法的要求，收集相應的臨床標本，最大限度保證檢測結(jié)果的可靠性。第一節(jié)臨床樣本的處理（二）樣本的運送樣本采集后，應盡快送至實驗室檢測，建議大多數(shù)樣本采集后在2~8℃的低溫條件下運送。（三）樣本的保存對于不能及時檢測的樣本，DNA樣本可在2~8℃下保存一周，RNA和蛋白質(zhì)樣本可在-20℃下短期凍存，長期不用的樣本可以-70℃或液氮中保存。第一節(jié)臨床樣本的處理二、常見臨床標本的處理方法1.血液：分子生物學檢驗中常見的臨床樣本，采集前應考慮飲食、藥物、采集時間等因素的影響，取樣時應避免溶血和產(chǎn)生泡沫。包括血清、血漿、全血、血細胞和無蛋白質(zhì)的血濾液等。2.體液：尿液、腦脊液、關(guān)節(jié)積液、漿腔膜積液等，離心后收集沉淀用于核酸提取。3.組織：術(shù)后臟器、組織等新鮮材料應迅速剝離脂類和結(jié)締組織，用生理鹽水沖洗干凈備用。第一節(jié)臨床樣本的處理4.細胞：貼壁生長細胞和懸浮細胞。5.痰液：去除黏蛋白和其他雜質(zhì)。6.棉拭子：呼吸道、消化道和生殖道等標本的采集。7.特殊樣本：帶毛囊的毛發(fā)、唾液、牙刷、口香糖、煙蒂、口杯、鼻血、精斑、指甲等。第一節(jié)臨床樣本的處理三、組織細胞的破碎第一節(jié)臨床樣本的處理破碎細胞機械法非機械法液體剪切法固體剪切法干燥法溶胞法：化學試劑、酶（方法溫和）不適合真核基因組DNA第二節(jié)DNA的分離與純化臨床檢驗中的DNA樣本包括真核生物DNA、細菌DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA等，結(jié)構(gòu)上有雙鏈環(huán)狀、雙鏈線性和單鏈環(huán)狀。DNA的分離與純化要遵循保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整和防止被RNA、蛋白及其他分子污染的原則。簡化操作步驟，盡量減少對DNA的破壞。一、基因組DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化（一）酚-氯仿抽提法以含EDTA、SDS和RNA酶的裂解緩沖液裂解細胞，蛋白酶K消化蛋白，然后用酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進行沉淀。獲DNA大小為100-150kb。第二節(jié)DNA的分離與純化主要試劑的作用

EDTA：1.二價金屬離子螯合劑，抑制DNA酶活性；

2.降低細胞膜的穩(wěn)定性。第二節(jié)DNA的分離與純化SDS：陰離子去垢劑1.溶解膜蛋白和脂肪，從而使細胞膜破裂；2.溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來；3.與蛋白質(zhì)形成復合物，使蛋白質(zhì)變性；4.對RNA、DNA酶有抑制作用。第二節(jié)DNA的分離與純化蛋白酶K：廣譜蛋白酶

水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細胞中的蛋白質(zhì)。蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時仍保持較高活性，可同時使用。第二節(jié)DNA的分離與純化無DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制DNA酶活性。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實驗中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。第二節(jié)DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化酚-氯仿抽提法——流程示意圖第二節(jié)DNA的分離與純化能有效變性蛋白質(zhì)，并抑制了DNA酶的降解作用采用實驗室常見的試劑和藥品，成本低。苯酚和氯仿毒性較大，DNA回收率較低，不能進行微量操作。第二節(jié)DNA的分離與純化（二）吸附柱法硅基質(zhì)材料吸附核酸的原理：主要利用DNA在高鹽低pH值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料相結(jié)合，在低鹽高pH值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料脫離的特征。其機理可能是高濃度鹽離子破壞了硅基質(zhì)水分子結(jié)構(gòu)，形成陽離子橋，當鹽被清除后，再水化的硅石破壞了基質(zhì)和DNA之間的吸引力，因而DNA從硅基質(zhì)上被洗脫下來。第二節(jié)DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化（三）磁珠法磁珠法的原理是采用納米級磁珠，表面標記了對DNA有吸附作用的特定活性官能團，能同DNA發(fā)生吸附，通過洗滌液洗滌后，加入洗脫液DNA釋放于洗脫液中。同時可以利用磁珠的磁性可以實現(xiàn)定向移動和聚集，不用離心就可以達到與雜質(zhì)分離的目的?？梢詫崿F(xiàn)高能量和自動化。第二節(jié)DNA的分離與純化二、質(zhì)粒DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化細菌的培養(yǎng)先分離單個菌落，接種到含少量適當抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，質(zhì)粒DNA也在自主復制。細菌的收集與裂解質(zhì)粒DNA的分離純化二、質(zhì)粒DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化

常用的堿裂解法，煮沸裂解法，SDS裂解法均可獲得較滿意效果。按制備量的不同質(zhì)粒DNA提取與純化的方法可分為小量制備（1-2ml）、中量制備（20-50ml）和大量制備（500ml）。第二節(jié)DNA的分離與純化（一）堿裂解法簡單、重復性好而且成本低，是使用最廣泛的方法在強堿NaOH（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細胞壁和裂解細胞，并使細胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。細胞裂解后，細胞壁、細胞膜的碎片、變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成大的復合物。當pH調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA重新恢復天然的超螺旋結(jié)構(gòu)，質(zhì)粒DNA保留在上清液中。第二節(jié)DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化（二）煮沸裂解法將細菌懸浮于含TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶能破壞細胞壁，再用沸水浴裂解細胞，并使宿主細胞的蛋白質(zhì)與DNA變性。質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會解鏈，當溫度下降后，可重新恢復其天然超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA,然后回收上清液中的質(zhì)粒DNA。第二節(jié)DNA的分離與純化煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取相對分子質(zhì)量小(＜15kb)的質(zhì)粒DNA，適用于大多數(shù)E.coli菌株。對于會釋放出大量糖類的菌株不適宜。如HB101及衍生菌。不適用于表達核酸內(nèi)切酶EndA的菌株。第二節(jié)DNA的分離與純化（三）SDS裂解法將細菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細胞壁用SDS裂解去壁細胞，溫和釋放質(zhì)粒到等滲液中用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA適合相對分子質(zhì)量大(＞15kb)的質(zhì)粒DNA的抽提，但產(chǎn)率不高。三、DNA的鑒定第二節(jié)DNA的分離與純化（一）DNA的濃度鑒定1.紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。如計算DNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液。（A值等于1時，相當于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，33μg/ml單鏈寡核苷酸）第二節(jié)DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化2.熒光光度法熒光染料溴化乙錠EB，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。1-5ng）致癌、致畸和致突變。第二節(jié)DNA的分離與純化溴化乙錠（EB）第二節(jié)DNA的分離與純化（二）DNA的純度鑒定1.紫外分光光度法通常：純的DNAA260/A280=1.8

污染：DNAA260/A280﹥1.8提示有RNA污染﹤1.8提示有蛋白質(zhì)或酚的污染通過A260

與A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)污染和鑒定核酸純度。第二節(jié)DNA的分離與純化2.熒光光度法用EB等熒光染料示蹤核酸電泳，純的DNA分子較RNA大，遷移率低，多于點樣孔附近匯集，可以鑒定DNA制品中有無RNA污染。第二節(jié)DNA的分離與純化RNA第二節(jié)DNA的分離與純化RNA第二節(jié)DNA的分離與純化（三）DNA完整性的鑒定降解：電泳圖呈拖尾狀四、DNA的保存第二節(jié)DNA的分離與純化

短期貯存：-20℃存放于TE（Tris和EDTA）緩沖液中可以保存2年。TE緩沖液的pH與DNA貯存有關(guān)，pH為8.0時，可減少DNA脫氨反應，pH低于7.0時DNA容易變性。EDTA抵制DNA酶活性。長期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。一、RNA提取的特殊要求第三節(jié)RNA的分離與純化RNA酶（RNase）是一類生物學活性穩(wěn)定的酶類，對RNA有強烈的降解作用，耐酸、耐堿、耐高溫，蛋白質(zhì)變性劑可使之失活，除去變性劑后又恢復活性。細胞內(nèi)、實驗室中的灰塵、各種實驗器皿、人體的汗液及唾液中均含有。第三節(jié)RNA的分離與純化為防止RNase對RNA的水解，一要全力避免細胞外RNase的污染并抑制其活性，二要盡快地抑制細胞內(nèi)RNase的活性并極力地去除RNase。對廣泛存在的細胞外RNase，應在RNA制備的全過程中保持高度的警惕，并采取嚴格的措施以避免其污染和抑制其活性。第三節(jié)RNA的分離與純化實驗室保持潔凈戴手套和口罩盡量選用一次性材料及新包裝的化學試劑，嚴格洗滌、消毒處理玻璃器皿200℃烘烤2h以上，不能烘烤的用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液處理。實驗試劑DEPC水處理，高溫高壓滅菌去除DEPC冰浴二、RNA的分離與純化技術(shù)第三節(jié)RNA的分離與純化（一）總RNA的分離與純化1.Trizol試劑法以含異硫氰酸胍、β-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的變性溶液裂解細胞在pH4.0的條件下，酚-氯仿抽提細胞裂解溶液通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌而獲得總RNA第三節(jié)RNA的分離與純化快速提取總RNA,具有適用范圍廣、操作簡便、純度高、污染小等特點。第三節(jié)RNA的分離與純化2.離心柱法硅基質(zhì)吸附方法，利用裂解液促使細胞破碎，使細胞中的核酸釋放出來，釋放出來的核酸特異的吸附在特定的硅載體上，這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力，對蛋白質(zhì)、多糖、脂類等其他成分基本不吸附，再把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來，分離得到純化的總RNA。第三節(jié)RNA的分離與純化可特異吸附核酸,使用方便、快捷，不使用有毒溶劑。第三節(jié)RNA的分離與純化3.磁珠法運用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和修飾后,制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能與RNA分子特異性地識別和高效結(jié)合。利用該納米微球的超順磁性,在一定條件下，對RNA具有極強的富集能力，當條件改變時可逆地釋放RNA,再經(jīng)清洗、洗脫等步驟，可以去除其他雜質(zhì)。第三節(jié)RNA的分離與純化具有高質(zhì)量、高產(chǎn)量、高通量，操作簡單快速，無毒無害的特點，易于實現(xiàn)流程自動化。第三節(jié)RNA的分離與純化（二）mRNA的分離與純化大多數(shù)真核細胞的mRNA的3‘-端通常帶有長短不一的腺苷酸組成的polyA尾巴，以總RNA為起始材料，利用堿基互補配對原理，寡聚胸腺嘧啶脫氧核糖核苷（OligoT）可以與之配對結(jié)合。寡聚（dT）-纖維柱層析法和磁珠法。第三節(jié)RNA的分離與純化1.寡聚（dT）-纖維柱層析法mRNA上的polyA尾巴可與具有OligoT的纖維素柱在高鹽條件下堿基配對發(fā)生親和吸附，在低鹽條件下，堿基配對被破壞，吸附解除，而其他成分的RNA不具這一特性。因此在高鹽條件下，當RNA抽提樣品經(jīng)流柱體時，mRNA被掛在柱上，其他RNA隨高鹽溶液流出，當用低鹽洗脫液洗柱時，mRNA被洗脫液流出，再用有機溶劑沉淀可得到純化的mRNA。第三節(jié)RNA的分離與純化第三節(jié)RNA的分離與純化第三節(jié)RNA的分離與純化2.磁珠法一般用生物素標記OligoT，親和素標記磁珠，生物素標記的OligoT和mRNA上的polyA高效雜交形成復合體，復合體可以和親和素標記磁珠結(jié)合，用磁性分離架可以將復合物分離，最后用無Rnase的去離子水將mRNA從復合物中洗脫出來即可。第三節(jié)RNA的分離與純化第三節(jié)RNA的分離與純化三、RNA的鑒定（一）RNA的濃度鑒定1.紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。如計算RNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×40＝μg/ml（A值等于1時，相當于40μg/mlRNA）第三節(jié)RNA的分離與純化2.熒光光度法熒光染料溴化乙錠EB，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出橙紅熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。第三