一種篩選抗藍(lán)耳病豬的usp18分子標(biāo)記育種方法及其應(yīng)用的制作方法

一種篩選抗藍(lán)耳病豬的usp18分子標(biāo)記育種方法及其應(yīng)用的制作方法專利名稱：一種篩選抗藍(lán)耳病豬的usp18分子標(biāo)記育種方法及其應(yīng)用的制作方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種篩選抗藍(lán)耳病豬的育種方法，通過(guò)判斷豬USP18基因5'調(diào)控區(qū)突變位點(diǎn)的多態(tài)性來(lái)進(jìn)行選種，并人為地應(yīng)用該突變位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)抗藍(lán)耳病豬的育種。背景技術(shù)：豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcine!^productiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)引起的一種病毒性傳染病。PRRS導(dǎo)致妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙，仔豬高死亡率以及各年齡段尤其仔豬的呼吸道疾病。豬的抗病性狀屬于中等遺傳力水平的閾性狀，由病毒引起的呼吸道疾病的抗性是可以遺傳的。Halbur等首先報(bào)道了關(guān)于PRRSV在豬品種之間存在著遺傳差異(Halburetal.，1998)。感染了PRRV的杜洛克、皮特蘭和長(zhǎng)白豬在平均日增重，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的比值和PRRSV誘導(dǎo)的肺損傷方面都存在著差異Vincentetal.,2005)。Vincen等(2006)利用流式細(xì)胞儀測(cè)定了外周血單核巨曬細(xì)胞對(duì)PRRSV感染率的差異，將豬群分為高易感、低易感2個(gè)系，于6周齡接種病毒，發(fā)現(xiàn)高易感系在接種21d后臨床癥狀更嚴(yán)重，且高易感系血清病毒滴度比低易感系高。Reiner等(2010)比較了德國(guó)地方品種小型豬和皮特蘭豬感染PRRSV后臨床狀態(tài)，病毒量和血清抗體轉(zhuǎn)換情況，發(fā)現(xiàn)皮特豬在感染后6d，病毒量達(dá)到最高，感染率為100%，小型豬在感染后12d病毒量達(dá)到高峰，感染率為87%，皮特蘭豬病毒復(fù)制量比小型豬高，小型豬產(chǎn)生更有效的抗體，結(jié)果表明這兩種豬對(duì)PRRSV反應(yīng)存在遺傳差異。以上結(jié)果表明豬對(duì)PRRSV的抗性存在遺傳差異，地方品種豬抗PRRSV的能力較強(qiáng)。豬不同品種間對(duì)PRRSV的抗性存在遺傳差異，這為抗藍(lán)耳病豬的育種提供了基礎(chǔ)和前提。從藍(lán)耳病的流行病學(xué)調(diào)查可以看出，易感豬多數(shù)為西方瘦肉型豬而我國(guó)的地方豬種染病的較少。大蒲蓮豬是山東省體型較大的華北型黑豬，具有抗病耐粗、多胎高產(chǎn)、哺育能力強(qiáng)、肉質(zhì)好等優(yōu)良特性。調(diào)查顯示，自2006年以來(lái)，在大批西方瘦肉型豬感染藍(lán)耳病死亡的情況下，大蒲蓮豬及大蒲蓮豬為母本的二元雜交豬均表現(xiàn)出對(duì)PRRSV超強(qiáng)的抗病能力。因此如何利用該特性研究對(duì)PRRSV超強(qiáng)的抗病能力，成為本領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題。發(fā)明內(nèi)容基于上述的原因，本發(fā)明通過(guò)篩選出豬抗藍(lán)耳病相關(guān)的基因標(biāo)記，建立豬分子標(biāo)記輔助育種方法，為豬抗藍(lán)耳病品種培育提供基因標(biāo)記和技術(shù)方法。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，發(fā)明人通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)攻毒后大蒲蓮豬和杜大長(zhǎng)雜交豬USP18基因的表達(dá)存在顯著差異，即攻PRRSV的大蒲蓮豬USP18表達(dá)顯著上調(diào)；通過(guò)對(duì)大蒲蓮豬和杜大長(zhǎng)雜交豬USP18基因調(diào)控區(qū)的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)一1533位點(diǎn)A到G改變會(huì)引起轉(zhuǎn)錄因子FOXIla的結(jié)合，進(jìn)而降低了USP18基因轉(zhuǎn)錄的功能，因此可以以一1533位點(diǎn)為A為分子標(biāo)記選擇USP18高表達(dá)的豬只組建基礎(chǔ)群進(jìn)行育種，對(duì)于提高豬群體的抗藍(lán)耳病特性具有重要的意義，可見檢測(cè)與突變相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記不僅方法簡(jiǎn)便快速，而且不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。USP18(ubiquitinspecificproteasel8)編碼去泛素化酶,屬于泛素特異性蛋白酶家族中的一員，通過(guò)識(shí)別干擾素刺激應(yīng)答元件啟動(dòng)子或與JAK競(jìng)爭(zhēng)與α-干擾素受體2(IFNAR2)的結(jié)合，負(fù)調(diào)控α-干擾素調(diào)控的信號(hào)通路；也是對(duì)α-干擾素敏感性及藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控因子；它的突變導(dǎo)致α/β_干擾素信號(hào)通路的超活化并抑制STAT4誘導(dǎo)的Y-干擾素的產(chǎn)生，使小鼠對(duì)沙門氏菌易感(Richeretal.，2010);研究證實(shí)，去泛素化從細(xì)胞生長(zhǎng)到先天性免疫反應(yīng)等很多調(diào)控過(guò)程中都起著重要的作用，例如癌癥、凋亡和疾病的感染(JohnstonandBurrows2006)。USP18基因敲除掉小鼠胚胎成纖維細(xì)胞干擾素的表達(dá)增強(qiáng)，抵抗由VSV和SNV引起的細(xì)胞病變，表明USP18在抵抗病毒侵染的免疫反應(yīng)中具有重要作用(Ritchieetal.，2011)。Zhang等(1999)的研究表明，豬感染PRRSV后，肺和扁桃體中USP18基因的表達(dá)顯著上調(diào)，與發(fā)明人觀察到的結(jié)果一致，表明USP18基因與豬的抗藍(lán)耳病有關(guān)。USP18的過(guò)表達(dá)有降低豬PRRSV復(fù)制的作用(Ait-Alietal.，2009)。本發(fā)明的發(fā)明人利用基因表達(dá)譜芯片及進(jìn)一步熒光定量PCR驗(yàn)證的結(jié)果都表明，攻毒后大蒲蓮豬和杜大長(zhǎng)雜交豬USP18基因的表達(dá)存在顯著差異，即攻PRRSV的大蒲蓮豬USP18表達(dá)顯著上調(diào)；通過(guò)對(duì)大蒲蓮豬和杜大長(zhǎng)雜交豬USP18基因5'調(diào)控區(qū)的對(duì)比，找到4處核苷酸序列的不同。并對(duì)一1533位點(diǎn)存在的A/G多態(tài)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。用TESS軟件預(yù)測(cè)一1533位點(diǎn)A到G改變引起轉(zhuǎn)錄因子FOXIla的結(jié)合。研究表明突變USP18基因一1533位點(diǎn)的FOXIla結(jié)合位點(diǎn)(A突變?yōu)镚)后，熒光素酶報(bào)告基因活性顯著降低，提示FOXIla可能有增強(qiáng)USP18基因轉(zhuǎn)錄的功能。而USP18基因的高表達(dá)與對(duì)豬對(duì)藍(lán)耳病的抗性有關(guān)。發(fā)明人認(rèn)為通過(guò)分子標(biāo)記篩選含有A等位基因的豬群進(jìn)行育種，可以獲得USP18聞表達(dá)的個(gè)體，對(duì)于提聞豬群的抗監(jiān)耳病特性具有重要意義。因此通過(guò)分子標(biāo)記選擇CYP3A88低表達(dá)的豬只組建基礎(chǔ)群進(jìn)行育種，對(duì)于提高豬群體的抗病性具有重要的育種意義。據(jù)此本發(fā)明提供了一種篩選抗藍(lán)耳病豬的育種方法，該方法是通過(guò)檢測(cè)豬基因組中USP185'調(diào)控區(qū)一1533位點(diǎn)的基因型實(shí)現(xiàn)的，所述的一1533位點(diǎn)的基因?yàn)锳的豬即為篩選出的目標(biāo)。其具體步驟如下:(I)犾得待檢測(cè)豬的基因組DNA；(2)以上述豬基因組DNA為模板，利用引物USP18BF，其序列如SeqIDNo:5所示和USP18BR，其序列如SeqIDNo:6所示，擴(kuò)增獲得含有一1533位點(diǎn)的USP185'調(diào)控區(qū)片段；(3)檢測(cè)上述USP185,調(diào)控區(qū)片段內(nèi)一1533位點(diǎn)多態(tài)性；(4)選擇USP185'調(diào)控區(qū)片段內(nèi)一1533位點(diǎn)的基因?yàn)锳的豬即為篩選出的目標(biāo)。篩選出的含有一1533位點(diǎn)且一1533位點(diǎn)的基因?yàn)锳的USP185'調(diào)控區(qū)片段，其序列如SeqIDNo:8所示。綜上所述，本發(fā)明人通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬USP185'調(diào)控區(qū)一1533位點(diǎn)A到G改變會(huì)引起轉(zhuǎn)錄因子FOXIla的結(jié)合，進(jìn)而降低了USP18基因轉(zhuǎn)錄的功能，因此可以以一1533位點(diǎn)為A為分子標(biāo)記選擇USP18高表達(dá)的豬只組建基礎(chǔ)群進(jìn)行育種，對(duì)于提高豬群體的抗藍(lán)耳病特性具有重要的意義，可見檢測(cè)與突變相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記不僅方法簡(jiǎn)便快速，而且不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。圖1為USP18PF和USP18PR引物PCR擴(kuò)增豬USP18啟動(dòng)子片段電泳圖；圖中，泳道I均為DLlOOOOmarker，泳道2為目的條帶；圖2大蒲蓮豬和杜大長(zhǎng)雜交豬熒光素酶活性比較結(jié)果示意圖；圖3為構(gòu)建刪除載體，轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞熒光素酶檢測(cè)結(jié)果示意圖；圖4為突變FOXIla位點(diǎn)后熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)載體的表達(dá)變化示意圖。具體實(shí)施例方式在本說(shuō)明書的上下文中，除非特別指明否則本說(shuō)明書所用的任何術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法是按照常規(guī)試驗(yàn)方法或按照供應(yīng)商所建議的操作說(shuō)明書進(jìn)行的。實(shí)施例1豬USP185'調(diào)控區(qū)序列的克隆基因組提取:取大蒲蓮豬和商品豬耳組織，按照TIANampgenomicDNA(天根)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行基因組DNA提取。根據(jù)NCBI(NCBIReferenceSequence:NC_010447.4)設(shè)計(jì)如下引物USP18PF基因序列如SeqIDNo:1所示,USP18PR基因序列如SeqIDNo:2所示,它包含了從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游22bp到上游246Ibp的范圍。權(quán)利要求1.一種篩選抗藍(lán)耳病豬的育種方法，其特征在于:該方法是通過(guò)檢測(cè)豬基因組中USP185'調(diào)控區(qū)一1533位點(diǎn)的基因型實(shí)現(xiàn)的，所述的一1533位點(diǎn)的基因?yàn)锳的豬即為篩選出的目標(biāo)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:具體步驟如下:(1)犾得待檢測(cè)豬的基因組DNA；(2)以上述豬基因組DNA為模板，利用引物USP18BF，其序列如SeqIDNo:5所示和USP18BR，其序列如SeqIDNo:6所示，擴(kuò)增獲得含有一1533位點(diǎn)的USP185'調(diào)控區(qū)片段；(3)檢測(cè)上述USP185'調(diào)控區(qū)片段內(nèi)一1533位點(diǎn)多態(tài)性;(4)選擇USP185'調(diào)控區(qū)片段內(nèi)一1533位點(diǎn)的基因?yàn)锳的豬即為篩選出的目標(biāo)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:篩選出的含有一1533位點(diǎn)的USP185'調(diào)控區(qū)片段，其序列如SeqIDNo:8`所示。全文摘要本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了豬USP18基因5′調(diào)控區(qū)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法及其在豬抗藍(lán)耳病育種中的應(yīng)用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在大蒲蓮豬和杜大長(zhǎng)雜交