粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列的制作方法

粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列的制作方法專利名稱：粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列的制作方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。本發(fā)明的粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起?！┇@得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過化學(xué)合成將突變弓|入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-PhaseP印tideSynthesis,WHFreemanCo.，SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。利用本發(fā)明的粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。本發(fā)明在提高粘毛黃芩黃酮類化合物含量上具有明顯的作用。提高該化合物的產(chǎn)量，以滿足全世界對黃芩苷等藥物的巨大需求。因此，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。具體實施例方式下面結(jié)合實驗室具體的試驗數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等《分子克隆實驗室手冊》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶的克隆1.組織分離(isolation)粘毛黃吝從山西大學(xué)購買，將種子播種于溫室中，待粘毛黃吝苗長至10cm高時，準備抽取DNA或RNA。2.RNA的分離(RNAisolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻槳器內(nèi)。勻槳后移至1.5mLEP管中，抽提總RNA(TRIzolReagents,GIBC0BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。3.基因的全長克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根據(jù)各種植物的二氫黃酮醇4-還原酶基因的核苷酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Clontech試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)核心片斷的克隆PCR[BPOOl[5，_GA(T/C)CC(T/C)GAGAATGA(G/A)GT(G/A)AT(T/A/C)AA-3，]+BP002[5，-TC(C/T)A(G/A/C)ATG(T/C/G)ACA(T/A)A(C/T)TG(C/A/T)CCTTG-3，]]得到416bp的核心片斷，回收后連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知黃芩的DFR基因的同源性很高，故初步認為它是一個二氫黃酮醇4-還原酶基因。(2)3，-RACE第一輪PCR[AP+BP003(5，-AATCTTGGCTGAGAAAGCAGCA-3')]連同第二輪PCR[AP+BP004(5'-CCCACCTAGCTTGATCACTGCA-3')]得到757bp3，端序列，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與黃芩的DFR基因的同源性很高，故初步認為它是一個二氫黃酮醇4-還原酶基因。(3)5，-RACE第一輪PCR[UMP+BP005(5，-TCCAGGTCACTCCAACTGGTTTC-3，)]連同第二輪PCR[(NUP+BP006(5'-CATCCCCTCAACCGTTGGCTTG-3')]得到201457bp5，端序列，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與白蘇的DFR基因的同源性很高，故初步認為它是一個二氫黃酮醇4-還原酶基因。將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，得到全長片段序列信息，并設(shè)計一對特異引物進行PCR擴增DFR編碼區(qū)(BP007F1(5，-ATGCCTTTGGTAACCACCATGG_3，)+BP007R1(5，-TCTGAGAAGTCGATCGAGGTGT-3'))得到DFR的編碼區(qū)(777bp)。BLAST的結(jié)果證明從粘毛黃芩中新得到的基因確為一個二氫黃酮醇4_還原酶基因。由于已知的同源二氫黃酮醇4-還原酶基因具有將二氫黃酮醇還原生成無色花色素的功能，故推測此基因具有相同的功能。通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶的全長編碼序列。在拼接得到全長(包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進一步設(shè)計引物BP008F1:5，-ACGCGGGGACAATCCTTGGCAT-3'(SEQIDNO.1)為正向引物，BP009Rl:5，-AATCCCAACGCAGCACTTACAT-3'(SEQIDNO.2)為反向引物，以總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，F(xiàn)1/R2的PCR條件為94。C預(yù)變性2min;然后94變性45s、55退火45s、72延伸2min;30個循環(huán)；最后72延伸lOmin;電泳檢測PCR產(chǎn)物，獲得擴增片斷長度為1283bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴增產(chǎn)物進行克隆，測序，獲得SEQIDNO.3所示的序列。實施例2粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因序列信息與同源性分析本發(fā)明新的二氫黃酮醇4-還原酶基因序列全長cDNA的長度為1283bp，詳細序列見SEQIDNO.3，其中開放讀框位于90-866位核苷酸(777個核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶氨基酸序列，共259個氨基酸殘基，分子量為28.59kDa，等電點(PI)為6.18。詳細序列見SEQIDNO.4。將粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因基因相關(guān)的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與白蘇二氫黃酮醇4-還原酶基因基因序列在核苷酸水平上具有84%的相同性(附表2);在氨基酸水平上，它與白蘇二氫黃酮醇4-還原酶基因DFR在蛋白水平上具有81%的相同性，(附表3)。由此可見，粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因與白蘇二氫黃酮醇4-還原酶基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認為粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶在黃酮類化合物生物合成途徑上也具有相似的作用。實施例3粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白或多肽在粘毛黃芩中進行真核細胞表達及轉(zhuǎn)基因植株中黃芩苷含量的檢測。含目的基因的表達載體的構(gòu)建，根據(jù)粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因編碼序列(SEQIDN0.3)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121和改進的pCAMBIA1304)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化粘毛黃芩。1.發(fā)苗采取粘毛黃芩成熟的種子，用0.1%(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡5分鐘，用無菌水沖洗6次；將粘毛黃芩種子接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于12rC滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加30g*L—1蔗糖，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5X瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)粘毛黃芩的幼芽，培養(yǎng)條件為25t:，黑暗條件下培養(yǎng)。待種子萌動后，改變培養(yǎng)條件為25t:，12小時光照，光照強度為25iimolm—2s—、等到植株片長到3cm高時可用于遺傳轉(zhuǎn)化。2.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將粘毛黃芩無菌苗的幼嫩葉片用小刀片削成約lcm2放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入共培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。3.除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入除菌培養(yǎng)基培養(yǎng)。4周繼代一次。待除菌培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)入抗性篩選培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)基因毛狀根初步篩選。除菌培養(yǎng)基MS+cb(250mgL—0篩選培養(yǎng)基MS+hygr(30mgL—"4.毛狀根的離體培養(yǎng)當毛狀根長至大約4cm長時切下，在不含任何植物激素的MS培養(yǎng)基上于25±1.(TC無光照的恒溫培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。每三周繼代一次，經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)后可進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，以進一步進行分子檢測。5.轉(zhuǎn)基因粘毛黃芩的分子檢測毛狀根DNA的提取和純化均參照《分子克隆實驗指南》(Sambrook，J.etal1993)根據(jù)Fumer等的Ri質(zhì)粒基因序列分析設(shè)計rolB、rolC基因的特異性引物。rolB基因的一對引物為5'-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3'和5'-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3'。rolC基因的一對引物為5'-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3'和5'-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3，。rolB、rolC基因的片段大小分別423bp和626bp。同時對基因進行PCR檢測。6.二氫黃酮醇4-還原酶在粘毛黃吝毛狀根中的northernblot分析l)RNA的提取利用TRIzol試劑盒(GIBC0BRL，USA)提取并參考《分子克隆實驗指南》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)提取粘毛黃芩轉(zhuǎn)基因毛狀根各個單克隆的RNA。2)RNA的定量參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook等，1989)，分光光度計測0D26。；RNA含量計算10D26。=40iigm1—1。3)總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離①取6ml25X(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。②稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55t:水浴中。③于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55t:的凝膠溶液中，混勻。④迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。⑤將提取的RNA(20iig)溶解于RNA變性溶液中，在65°C下加熱IO分鐘，然后立即放在冰上。⑥在樣品中加入2ulIOX上樣緩沖液，混勻。⑦在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。4)RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移①轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10XSSC浸泡。②將濕潤的膜準確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2XSSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。③濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時。④轉(zhuǎn)移后，將膜于8(TC烘烤2小時。5)膜上雜交信號的檢出①將膜浸在5XDendart，s，O.1%SDS，O.lmgm1—1鮭魚精DNA，65。C下預(yù)雜交2小時。②將用GeneImagesContentsCDP-Starlabellingmodule標記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入①的雜交液中，于65。C雜交16-24小時。③取出膜，置于洗膜液I(1XSSC，1XSDS)中，于65t:漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液11(0.1XSSC，1%SDS)中于65t:漂洗3次，每次15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照RocheDIGlabeled試劑盒說明書)。7.轉(zhuǎn)二氫黃酮醇4-還原酶的粘毛黃芩毛狀根黃芩苷的HPLC分析黃芩苷的提取將培養(yǎng)30d的單克隆毛狀根洗凈，用吸水紙吸干水分，稱鮮重后冷凍干燥30h至恒重，研磨成粉，稱取100mg干粉加入10mL甲醇超聲破碎20min，過濾，再提取一次，合并濾液，將甲醇提取液濃縮蒸干，用甲醇定容至lOrnl，_20°〇保存，作為供試樣品溶液，可用于HPLC分析。高壓液相檢測標準品的制備精密稱取2mg黃芩苷標準對照品，用色譜純甲醇溶解過濾，配成濃度為1000iigmL—、分別梯度稀釋成280、140、70、35、17.5iigmL—、在相應(yīng)的色譜條件下進樣，且每一濃度進樣三次，記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積對進樣量回歸分析，得對照品的線性回歸方程和標準曲線。高壓液相檢測條件色譜柱為Symmetry-C18柱(4.6mmX150mm，5ym)，流動相甲醇0.2mo1L—1磷酸二氫鈉溶液(45:55)，流速0.8mLmin—、柱溫25°C。檢測波長280nm。黃吝苷大約在7.7min處出峰。序列表〈110>西南大學(xué)〈120〉粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列〈140〉〈141〉〈160>4〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>22bp〈212>DNA〈213>粘毛黃吝(ScutellariaviscidulaB皿ge)〈400>1ACGCGGGGACAATCCTTGGCAT〈210>2〈211>22bp〈212>DNA〈213>粘毛黃吝(ScutellariaviscidulaB皿ge)〈400>2AATCCCAACGCAGCACTTACAT〈210>3〈211>1283〈212>DNA〈213>粘毛黃吝(ScutellariaviscidulaB皿ge)〈220>1〈221>CDS〈222>(90).(866)〈223〉〈400>3AC2GCGGGGACAATCCTTGGCATTGGTTCAAACTTGTCTTAAMTTTAATATATAGTTCCAAT62CCAACCCMATATCTCACTTCCTAAACATGCCTTTGGTAACCACCATGGCCATGCCACCT122MetProLeuValThrThrMetAlaMetProPro1510CCAGCCACGACAGTATGTGTCACCGGAGCATCTGGCTTCATCGGCTCATGGCTCGTCATG182ProAlaThrThrValCysValThrGlyAlaSerGlyPhelieGlySerTrpLeuValMet15202530AGACTCCTCCAGCATGGTTATATTGTTCGTGCAACTGTTCGTGATCCTGGGMCATGGAG242ArgLeuLeuGinHisGlyTyrlieValArgAlaThrValArgAspProGlyAsnMetGlu35404550MGGTGAMCACCTAACGGAACTGCCACMGCAGACACAMGTTGACACTGTGGAAGGCA302LysValLysHisLeuThrGluLeuProGinAlaAspThrLysLeuThrLeuTrpLysAla55606570GATATGAGCATACMGGAAGCTACGACAMGCAGTACAAGGTTGTGMGGGGTGTTTCAC362AspMetSerlieGinGlySerTyrAspLysAlaValGinGlyCysGluGlyValPheHis75808590ATGGCCACACCTATGGATTTCGMTCCAATGATCCTGAGMTGMGTGATCMGCCAACG422MetAlaThrProMetAspPheGluSerAsnAspProGluAsnGluVallieLysProThr95100105110GTTGAGGGGATGTTGMCATCATAAGATCATGTGCCMAGCCAMACTGTGMGAAATTG482ValGluGlyMetLeuAsnlielieArgSerCysAlaLysAlaLysThrValLysLysLeu115120125130ATATTCACAACCTCAGCAGGGACACTGAATGTTGAAGAACACCAGAMCCAGTTTATGAT542liePheThrThrSerAlaGlyThrLeuAsnValGluGluHisGinLysProValTyrAsp135140145150GAAACCAGTTGGAGTGACCTGGATTTCATTTACTCCMGAMATGACTGGATGGATATAT602GluThrSerTrpSerAspLeuAspPhelieTyrSerLysLysMetThrGlyTrplieTyr155160165170TTTTTGTCTAMATCTTGGCTGAGAMGCAGCAATGGAAGCAACTAMGAGMTAATATC662PheLeuSerLyslieLeuAlaGluLysAlaAlaMetGluAlaThrLysGluAsnAsnlie175180185190MCTTAATTACTGTCATACCACCTCTAGTGGTTGGTCCATTCATCATGCCCACCCTCCCA722AsnLeulieThrVallieProProLeuValValGlyProPhelieMetProThrLeuPro195200205210CCTAGCTTGATCACTGCACTTTCCCCCATTACTGGGMTGAAGCCCACTATTTACTATCA782ProSerLeulieThrAlaLeuSerProlieThrGlyAsnGluAlaHisTyrLeuLeuSer215220225230GGATTCAGTGACAGTCACTCTCMGGGACAAGAACTGGAGCTGMAMGATTCTTACAAT842GlyPheSerAspSerHisSerGinGlyThrArgThrGlyAlaGluLysAspSerTyrAsn235240245250CTACACCTCGATCGACTTCTCAGATMCCATCTCGTTGGMCAATTCCTCAMCAGTTGG902LeuHisLeuAspArgLeuLeuArg:氺265TGAGCTGMATCCCTGTATTTTCTCMCCTCTCCCACAATGCTCTCTCTGGCCACATCCC962ATCATCGATAGGAMTCTACAGMGCTCGAGTCATTGGATCTCTCACTCMCAGTCTCGA1022CGGAGAAATCCCGAGGCAGCTTGCAAGCCTCACGTTCCTCTCATTCTTGAACGTGTCTTA1082CAACCATCTTGTTGGGAGGATCCCAGAAGGGAGCCAMTCCAGACATTTCCAGAGAGTTC1142CTTCATCGGAMCGAGGGGCTTTGTGGGTTTCCTTTGAACMAACCTGCAATGGCACTGG1202MCATCATCATCATCGTCATCGCCGGAGTTTCCACGGGGGMGTTGGAGGGAGAGATATA1262TGTAAGTGCTGCGTTGGGATT1283〈210>4〈211>259〈212>PRT〈213>粘毛黃吝(ScutellariaviscidulaB皿ge)〈400>4MetProLeuValThrThrMetAlaMetProProProAlaThrThrValCysValThrGlyAla15101520SerGlyPhelieGlySerTrpLeuValMetArgLeuLeuGinHisGlyTyrlieValArgAla25303540ThrValArgAspProGlyAsnMetGluLysValLysHisLeuThrGluLeuProGinAlaAsp45505560ThrLysLeuThrLeuTrpLysAlaAspMetSerlieGinGlySerTyrAspLysAlaValGin65707580GlyCysGluGlyValPheHisMetAlaThrProMetAspPheGluSerAsnAspProGluAsn859095100105GluVallieLysProThrValGluGlyMetLeuAsnlielieArgSerCysAlaLysAlaLys110115120125ThrValLysLysLe