酶與酶工程知識課件

酶與酶工程知識課件酶的概念

酶是一類由活細胞產(chǎn)生的對其特異底物具有高效催化作用的特殊蛋白質(zhì)或核酸。

簡單地說，酶是一類由活細胞產(chǎn)生的生物催化劑。酶作為生物催化劑的特點：高效性專一性反應條件溫和酶的催化活性可調(diào)節(jié)控制(一)根據(jù)酶的化學組成分類：

1、單純酶：只含有蛋白質(zhì)成分，如：脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等。

2、結合酶：含有蛋白成分(酶蛋白)和非蛋白成分(輔助因子)。

酶的分類*兩部分在催化反應中的作用酶蛋白決定反應的特異性。輔助因子決定反應的種類與性質(zhì)。蛋白質(zhì)部分：酶蛋白輔助因子金屬離子小分子有機化合物全酶維生素鐵卟啉

(二)根據(jù)酶蛋白結構特點分類單體酶：由一條肽鏈組成的酶分子。寡聚酶：由兩條或多條肽鏈組成的酶分子，為大多數(shù)酶。多酶復合體：由多種酶彼此聚合形成的復合體,催化連續(xù)的一系列相關反應。丙酮酸脫氫酶復合體。多功能酶：一條多肽鏈上含有兩種或兩種以上催化活性的酶，往往是基因融合的產(chǎn)物。高等動物的脂肪酸合酶。由幾種不同功能的酶彼此聚合形成的多酶復合物。

一些多酶體系在進化過程中由于基因的融合，多種不同催化功能存在于一條多肽鏈中，這類酶稱為多功能酶。由單肽鏈構成的，含有若干個酶活性結構域。

活性中心：酶分子中結合底物并起催化作用的少數(shù)氨基酸

殘基形成的一定空間結構。包括底物結合部位和催化部位。酶的活性中心酶活性中心

結合部位：與底物結合，使底物與酶的一定構象形成復合物，決定酶的專一性。催化部位：影響底物中某些化學鍵的穩(wěn)定性，催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的部位，決定酶的催化效率和催化反應的性質(zhì)。酶活性中心的特點a.酶的活性中心位于酶分子表面的”空穴“中，為非極性環(huán)境。b.酶的活性中心只有幾個氨基酸組成，多為極性氨基酸。c.活性中心的幾個氨基酸殘基在一級結構上可能相距很遠，甚至位于不同肽鏈上，通過肽鏈的盤繞折疊而在空間結構上相互靠近，形成一個能與底物結合并催化底物形成產(chǎn)物的位于酶蛋白分子表面的特化的空間區(qū)域。d.酶的活性中心具有柔性，可與底物誘導契合發(fā)生相互作用。e.酶的活性中心與底物的結合通過次級鍵。酶活性中心的特點必需基團：

在酶分子中有一些基團對維持酶活性中心應有的空間構象及發(fā)揮正常的催化活性是必需的，若將這些基團改變后會導致酶的催化活性減弱甚至喪失。

活性中心內(nèi)外都可以有必需基團酶必需基團非必需基團活性中心活性中心外基團結合基團催化基團酶的專一性機制

誘導契合學說

該學說認為酶表面并沒有一種與底物互補的固定形狀，而只是由于底物的誘導才形成了互補形狀。E+SP+EES能量水平反應過程

G

E1

E2

酶（E）與底物（S）結合生成不穩(wěn)定的中間物（ES），再分解成產(chǎn)物（P）并釋放出酶，使反應沿一個低活化能的途徑進行，降低反應所需活化能，所以能加快反應速度

E+SE-S

P+E中間產(chǎn)物學說酶的高效性機制鄰近效應和定向效應

在酶促反應中，底物分子結合到酶的活性中心一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應速度；另一方面，由于活性中心的立體結構和相關基團的誘導和定向作用，使底物分子中參與反應的基團相互接近，并被嚴格定向定位，使酶促反應具有高效率和專一性特點

鄰近定向效應酶促反應動力學

酶促反應動力學是研究酶促反應的速度以及影響酶反應速度的各種因素的科學影響酶反應速度的因素有：

底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑、抑制劑等在低底物濃度時,反應速度與底物濃度成正比，為一級反應底物濃度增大與速度的增加不成正比,為混合級反應當?shù)孜餄舛冗_到一定值，幾乎所有的酶都與底物結合后，反應速度達到最大值V

max，此時再增加底物濃度，反應速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應底物濃度對酶促反應速度的影響V-S曲線底物濃度對酶促反應初速度的影響V

初Vmax低1913年，德國化學家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學說對酶促反應的動力學進行研究，推導出了表示整個反應中底物濃度和反應速度關系的著名公式，稱為米氏方程米氏方程酶濃度對酶反應速度的影響

在有足夠底物和其他條件不變的情況下，反應速度與酶濃度成正比

即：當[S]>>[E]時，V=Km×[E]溫度對酶反應速度的影響

一方面是溫度升高,酶促反應速度加快另一方面,溫度升高,酶的高級結構將發(fā)生變化或變性，導致酶活性降低甚至喪失因此大多數(shù)酶都有一個最適溫度。在最適溫度條件下,反應速度最大最適溫度不是一個固定的常數(shù)pH對酶反應速度的影響

酶反應的最適pH(optimumpH)

酶的最適pH也不是一個固定的常數(shù)，它受到底物的種類、濃度；緩沖液的種類、濃度;酶的純度;反應的溫度、時間等的影響激活劑對酶反應速度的影響

1.無機離子

(1)一些金屬離子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、

Cu2+、Zn2+、Fe2+等(2)陰離子：如Cl-、Br-、I-、CN-等凡能提高酶活力的物質(zhì)都是酶的激活劑,激活劑對酶的作用具有一定的選擇性

2.有機分子

還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金屬螯合劑：EDTA抑制劑對酶活性的影響

能夠引起酶的活性降低或喪失的化合物稱為抑制劑。具有不同程度的選擇性

抑制作用類型：(一)不可逆抑制作用：

抑制劑與酶反應中心的活性基團共價結合，引起酶的永久失活

(二)可逆抑制作用抑制劑與酶蛋白以非共價方式結合，引起酶活性暫時性喪失。抑制劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復酶的活性常見的不可逆抑制劑1）有機磷化合物、有機汞、有機砷化合物(抑制-SH巰基酶)、氰化物、烷化劑(碘乙酸、碘乙酰胺)等。2）二異丙基氟磷酸(DIPF)對含Ser-OH的酶的不可逆抑制。均為劇毒物質(zhì)膽堿乙?；改憠A酯酶膽堿乙酰膽堿有機磷殺蟲劑能抑制膽堿酯酶活性，導致乙酰膽堿的堆積，造成神經(jīng)過度興奮直至抽搐而死乙酰膽堿----傳遞神經(jīng)沖動有機磷農(nóng)藥（敵百蟲、沙林）膽堿酯酶OHPOC2H5OC2H5S有機磷農(nóng)藥神經(jīng)傳導中毒?。?！

抑制劑二異丙基氟磷酸酯引起酶的永久失活竟爭性抑制

某些抑制劑的化學結構與底物相似，因而能與底物竟爭與酶活性中心結合。當抑制劑與活性中心結合后，底物被排斥在反應中心之外，其結果是酶促反應被抑制可逆抑制作用分為三類：非竟爭性抑制

酶可同時與底物及抑制劑結合，引起酶分子構象變化，并導致酶活性下降。抑制劑與活性中心以外的基團結合，不與底物競爭酶的活性中心反競爭性抑制作用

ESIESP+EE+S+I

酶只有在與底物結合后，才能與抑制劑結合，引起酶活性下降P+E×酶的活性調(diào)節(jié)酶的活性調(diào)節(jié)包括兩個方面：

調(diào)節(jié)酶濃度：

酶的誘導與阻遏、酶的選擇性降解

調(diào)節(jié)酶活性：

變構調(diào)節(jié)、可逆共價修飾、酶原激活

變構調(diào)節(jié)

當酶分子與某些化合物非共價結合后發(fā)生構象改變，從而引起酶活性的變化，這種調(diào)節(jié)稱別構調(diào)節(jié)。受別構調(diào)節(jié)的酶稱變構酶(或別構酶)，引起酶的活性受到別構調(diào)節(jié)的化合物稱效應物(或變構劑)

正效應物—變構激活

負效應物—變構抑制

共價調(diào)節(jié)酶

常見的是磷酸化/脫磷酸化，腺苷?；?脫腺苷?；?，乙?；?脫乙?；?，尿苷?；?脫尿苷?；?，甲基化/脫甲基化，S-S/SH相互轉(zhuǎn)變

酶分子被其他酶催化進行可逆的共價修飾，引起酶活性的改變共價調(diào)節(jié)酶最典型的例子是動物組織的糖原磷酸化酶

磷酸化酶磷酸酶磷酸化酶激酶

磷酸化酶a（有活性）

磷酸化酶b（無活性）

磷酸化酶a和磷酸化酶b的轉(zhuǎn)變過程+酶原及酶原的激活

1.酶原(zymogen)：酶的無活性的前體2.酶原的激活：從無活性的酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿傅倪^程3.酶原激活的本質(zhì)：是酶活性部位形成或暴露的過程酶原存在的意義

消化道內(nèi)蛋白酶以酶原形式分泌，避免細胞產(chǎn)生的蛋白酶對細胞進行自身消化，并使酶在特定部位和環(huán)境中發(fā)揮作用；此外，酶原可視為酶的儲存形式，如凝血和纖維蛋白溶解酶類以酶原的形式在血液循環(huán)中運行，一旦需要便轉(zhuǎn)化為有活性的酶胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意圖

胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶胰蛋白酶對各種胰臟蛋白酶的激活作用

胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶盡管人類19世紀前后才建立起酶的概念，但酶的催化作用卻很早就為人們的生活所利用比如：(1)在人類游牧生活時期，就已會利用動物胃液來凝固牛乳(2)人類在4000多年前就已掌握的釀酒和制醬技術其實也是酶作用的結果

最初的商品酶制劑主要以動植物為原料提取，如從牛胃中提取凝乳酶、從胰臟中提取胰酶、從血液中提取凝血酶、從植物材料中提取淀粉酶等

之后，Takamine利用霉菌來生產(chǎn)淀粉酶使得酶制劑工業(yè)取得突破，其方法至今仍被采用

第二次世界大戰(zhàn)以后，隨著微生物培養(yǎng)技術、發(fā)酵工業(yè)和設備的漸漸完善，利用微生物獲得商品化酶制劑已形成規(guī)模化產(chǎn)業(yè)，并開辟了廣闊的市場

20世紀90年代，隨著基因工程的廣泛介入，一些原來只能由動物或植物生產(chǎn)的酶，經(jīng)過酶基因重組，可以在微生物上表達

由于在發(fā)酵過程中很容易對微生物進行控制，因此“基因工程＋發(fā)酵工藝＋先進的發(fā)酵設備”可以算是酶工業(yè)的第三次飛躍

酶工程酶工程：酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)和應用酶工程研究簡史

1894年，日本的高峰讓吉用米曲霉制備得到淀粉酶，開創(chuàng)了酶技術走向商業(yè)化的先例

1908年，德國的Rohm用動物胰臟制得胰蛋白酶，用于皮革的軟化及洗滌

1908年，法國的Boidin制備得到細菌淀粉酶，用于紡織品的褪漿

1911年，Wallerstein從木瓜中獲得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清

1949年，用微生物液體深層培養(yǎng)法進行－淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)，揭開了近代酶工業(yè)的序幕

1960年，法國科學家Jacob和Monod提出的操縱子學說，闡明了酶生物合成的調(diào)節(jié)機制，通過酶的誘導和解除阻遏，可顯著提高酶的產(chǎn)量

在酶的應用過程中，人們注意到酶的一些不足之處，如：穩(wěn)定性差，對強酸堿敏感，只能使用一次，分離純化困難等解決的方法之一是固定化1971年第一屆國際酶工程學術會議在美國召開,當時的主題即是固定化酶，進一步開展了對微生物細胞固定化的研究1973年,千煙一郎首次利用固定化的大腸桿菌細胞生產(chǎn)L-天冬氨酸1978年,日本的鈴木等固定化細胞生產(chǎn)α-淀粉酶研究成功，所以70年代是固定化細胞技術取得進展的時期80年代，固定化細胞已能用于生產(chǎn)胞外酶，又發(fā)展了固定化原生質(zhì)體技術，排除了細胞壁這一障礙在酶的固定化技術發(fā)展的同時，酶分子修飾技術也取得了進展60年代，用小分子化合物修飾酶分子側鏈基團，使酶性質(zhì)發(fā)生改變70年代，修飾劑的選用、修飾方法上又有了新的發(fā)展此外，對抗體酶、人工酶、模擬酶等方面，以及酶的應用技術研究，在近20年均取得了較大進展，使酶工程不斷向廣度和深度發(fā)展，顯示出廣闊而誘人的前景化學酶工程

由酶學與化學工程技術相結合而形成通過化學修飾、固定化處理、甚至化學合成法等手段改善酶的性質(zhì)，以提高催化效率及降低成本包括：天然酶

固定化酶化學修飾酶