GB-T酶制劑生理活性評價技術(shù)規(guī)范征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

酶制劑生理活性評價技術(shù)規(guī)范

TechnicalspecificationsofphysiologicalactivitymeasureforEnzyme

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局

中國國家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會

GB/T××××—201×

酶制劑生理活性評價技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了酶制劑生理活性評價原理、儀器和設(shè)備、試劑和材料、析步驟及結(jié)果計算。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料、食品等酶制劑的生理活性評價。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本

適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB5009.124食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定

GB/T5009.7食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食中還原糖的測定；

GB5009.168食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測定；

中華人民共和國獸藥典（2015年版）

3術(shù)語與定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1酶制劑Enzyme

由動物或植物的可食或非可食部分直接提取，或由傳統(tǒng)或通過基因修飾的微生物（包括

但不限于細菌、放線菌、真菌菌種）發(fā)酵、提取制得，用于食品加工或提高飼料轉(zhuǎn)化率等，

具有特殊催化功能的生物制品。

3.2體外消化模型Invitrodigestionmodel

通過模擬人或者動物消化生理特點，采用與人或動物體內(nèi)相近的消化環(huán)境和消化酶系，

在體外評定外加酶作用或飼料消化吸收的一種方法。

3.3生理活性physiologicalactivity

酶制劑在人或動物體內(nèi)消化環(huán)境中，受溫度，pH等因素影響所表現(xiàn)出的對底物的消化

能力。

3.4模擬胃消化液stimulatedgastricfluid

模擬人或動物體胃液中的pH、鹽離子濃度及蛋白酶濃度設(shè)置的消化液。

3.5模擬腸消化液stimulatedintestinalfluid

模擬人或動物體腸液中的pH、鹽離子濃度及胰酶濃度設(shè)置的消化液。

GB/T××××—201×

4原理

首先用胃蛋白酶在酸性條件下處理含有酶制劑樣品的底物，完成在模擬胃內(nèi)的消化過程，

然后再用含有蛋白酶和脂肪酶的胰酶在中性條件下繼續(xù)消化，完成養(yǎng)分在小腸內(nèi)的消化過程，

最后分離已消化與未消化養(yǎng)分，通過分析酶制劑對主要底物的轉(zhuǎn)化效率，以達到預(yù)測食品或

飼料中的酶制劑在體內(nèi)的生理活性的目的。

5試劑和材料

5.1胃蛋白酶

活性大于1:3800生化級胃蛋白酶（臨用前可按《中華人民共和國獸藥典》中規(guī)定的方

法測定胃蛋白酶活性）。

5.2胰酶

為胰蛋白酶與胰脂肪酶的復(fù)合制品，每種酶的酶活性應(yīng)大于1:3800。

5.31M鹽酸溶液

用量筒準(zhǔn)確量取8.18mL濃鹽酸，倒入已經(jīng)裝有60mL蒸餾水的燒杯中，不斷攪拌，待

冷卻后轉(zhuǎn)移到容量瓶中并定容至100mL。

5.41M氫氧化鈉溶液

準(zhǔn)確稱取4g氫氧化鈉試劑溶解于裝有60mL蒸餾水的燒杯中，冷卻后，再轉(zhuǎn)移到100mL

的容量瓶中并定容至100mL。

5.5胃電解質(zhì)溶液

3.1g氯化鈉、1.1g氯化鉀、0.15g氯化鈣，0.6g碳酸氫鈉溶解于1L的去離子水中。

5.6體外模擬胃液

800mg胃蛋白酶加入到10mL胃電解質(zhì)溶液中，混合均勻，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH

值至2.8。

5.7腸電解質(zhì)溶液

5.4g氯化鈉，0.65g氯化鉀，0.33g氯化鈣溶解于1L去離子水中。

5.8體外模擬腸液

2.0g胰酶加入到10mL腸電解質(zhì)溶液中，混合均勻，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值

至6.5。

6.儀器和設(shè)備

GB/T××××—201×

6.1電子分析天平：精度0.001g。

6.2pH計：精確至0.01。

6.3恒溫生化培養(yǎng)箱：震蕩120次/min，溫度精度0.1℃。

6.4秒表。

6.5移液槍：精度為0.1μL。

7分析步驟

7.1稱樣

固體酶制劑：稱取0.05g，精確到0.0001g，溶于1mL模擬胃液中備用；

液體酶制劑：準(zhǔn)確量取50μL，精度0.1μL，用模擬胃液定容至1mL，備用。

7.2體外消化試驗：

7.2.1實驗組：

胃模擬消化階段：準(zhǔn)確稱取1.0g食品模擬物（1:1:1，淀粉+大豆油+雞蛋白）或飼料模

擬物（1:1:1，玉米+小麥+豆粕），精確到0.0001g，放入50mL具塞三角瓶中，將待測酶

制劑樣品溶液（7.1）置于三角燒瓶中，再加入8mL胃電解質(zhì)溶液（5.5），用1M鹽酸溶液

將pH值調(diào)至2.8，混合均勻后靜止10min，加入1mL體外模擬胃液（5.6）?；旌暇鶆蚝蠓?/p>

入生化培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃振蕩消化（120次/min），消化時間4h。

小腸模擬消化階段：在胃模擬消化的樣品中再加入9mL中腸電解質(zhì)溶液（5.7），用1M

氫氧化鈉溶液調(diào)整轉(zhuǎn)移后液的pH值至6.5。然后加入1mL體外模擬腸液（5.8）?；旌暇?/p>

勻后放放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃振蕩消化（120次/min），消化時間16h。

7.2.2對照組：

以不加酶制劑，而其它處理與實驗組相同的錐形瓶作為對照組。

7.2.3實驗空白組：

以不加食品模擬物，而其它處理與實驗組相同的錐形瓶作為實驗空白組。

7.2.4對照空白組：

以不加食品模擬物，而其它處理與對照組相同的錐形瓶作為對照空白組。

7.3濾液及殘渣處理：

消化結(jié)束后，將三角燒瓶中的殘留物用去離子水完全沖洗到漏斗中過濾。將濾液收集到

50mL容量瓶中，搖勻，用去離子水定容至50mL，待用。將過濾后的濾紙及殘渣轉(zhuǎn)移培養(yǎng)

皿中，待用。

GB/T××××—201×

7.4分析步驟

7.4.1干物質(zhì)測定

將殘渣及濾紙在65℃烘干1h，稱重，再置入烘箱30min，如此反復(fù)烘干至恒重（以2

次之差小于0.0005g為準(zhǔn)），最后一次稱重即為干物質(zhì)質(zhì)量。

7.4.2游離氨基酸測定

從50mL容量瓶中取10mL液濾，過0.22μm濾膜，按《GB5009.124食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品中氨基酸的測定》方法進行測試，計算濾液中游離氨基酸含量。

7.4.3脂肪酸測定

從50mL容量瓶中取10mL濾液，過0.22μm濾膜，按《GB5009.168食品安全國家標(biāo)

準(zhǔn)食品中脂肪酸的測定》方法進行測試，計算濾液中脂肪酸的含量。

7.4.4還原糖測定

從50mL容量瓶中取10mL濾液，過0.22μm濾膜，按《GB/T5009.7食品安全國家標(biāo)

準(zhǔn)食品中還原糖的測定》方法進行測試，計算濾液中還原糖的含量。

注：7.4.2，7.4.3，7.4.4所檢測的項目根據(jù)酶的種類，選擇性檢測。

8.結(jié)果計算

8.1干物質(zhì)消化率的計算

干物質(zhì)體外消化率按照公式（1）進行計算：

干物質(zhì)體外消化率(1)

?1??0

?

M——食品模擬物干物質(zhì)質(zhì)量（g）；A=100%?×100%

M1——濾渣干物質(zhì)質(zhì)量（g）；

M0——空白組濾渣干物質(zhì)質(zhì)量（g）。

8.2游離氨基酸體外生成率的計算

游離氨基酸體外生成率按照公式（2）進行計算：

游離氨基酸體外生成率（）

''(2)

?1??0?1??0

'

式中：B%=(?????)×100%

MT——實驗組食品模擬物干物質(zhì)質(zhì)量（g）；

MT′——對照組食品模擬物干物質(zhì)質(zhì)量（g）；

P1——實驗組濾液中游離氨基酸的含量（g）；

GB/T××××—201×

P1′——空白組濾液中游離氨基酸的含量（g）；

P0——實驗空白組濾液中游離氨基酸的含量（g）；

P0′——對照空白組濾液中游離氨基酸的含量（g）。

8.3脂肪酸體外生成率的計算

脂肪酸體外生成率按照公式（3）進行計算：

脂肪酸體外生成率

''(3)

?1??0?1??0

'

式中：C=(?????)×100%

MT——實驗組食品模擬物干物質(zhì)質(zhì)量（g）；

MT′——對照組食品模擬物干物質(zhì)質(zhì)量（g）；

F1——實驗組濾液中脂肪酸的含量（g）；

F1′——空白組濾液中脂肪酸的含量（g）；

F0——實驗空白組濾液中脂肪酸的含量（g）；

F0′——對照空白組濾液中脂肪酸的含量（g）。

8.4還原糖體外生成率的計算

還原糖體外生成率按照公式（4）進行計算：

還原糖體外生成率

''(4)

?1??0?1??0