微生物快速檢測方法

關于微生物快速檢測方法常見微生物檢測項目常規(guī)微生物項目細菌總數、大腸菌群、大腸桿菌、霉菌及酵母菌致病微生物項目沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等第2頁,共31頁，2024年2月25日，星期天傳統(tǒng)計數改良法1、培養(yǎng)膜法2、螺旋平板計數法：螺旋接種儀＋菌落計數3、濾膜法：常用于一些可過濾樣品的檢測快速檢測的新方法1、ATP生物熒光法2、電阻抗法3、顏色變化4、流式細胞技術及激光掃描技術5、其它：熱量法，放射測量法常規(guī)微生物檢測方法第3頁,共31頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術原理

二片塑料膜構成，上薄為蓋，下厚為培養(yǎng)基。操作方法：

檢樣稀釋→取1ml滴于下膜正中央→蓋上膜→擴展器壓成20cm2圓圈→37℃培養(yǎng)24h→計數(顯色的斑點)第4頁,共31頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術優(yōu)點：可節(jié)約玻璃儀器、培養(yǎng)基?？晒?jié)省培養(yǎng)基等試劑的配置滅菌和玻璃儀器滅菌和清洗的時間、人力和費用。因為有顯色劑和小方格，計數方便。節(jié)約稀釋的繁瑣動作?？煽焖贉y試致病菌，節(jié)省大量的實驗步驟。缺點成本比傳統(tǒng)方法要稍高些。測試細菌總數、大腸菌群、霉菌和酵母菌時不能節(jié)約培養(yǎng)時間。第5頁,共31頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術應用細菌總數測試片中含有一種紅色指示染劑，使所有菌落易認別計數。大腸菌群測試片中含有指示劑，使菌落為紅色，且有氣泡產生。大腸桿菌指示劑可使所有菌落為紅色，并可留住大腸桿菌產生的氣泡。

24小時可確定大腸桿菌數。第6頁,共31頁，2024年2月25日，星期天霉菌和酵母菌計數測試片中加入的抗生素，可以抑制細菌生長；指示劑使酵母菌易認別計數；霉菌可產生特有的色澤。金黃色葡萄球菌使用了具有熱穩(wěn)定的核酸酶反應片，核酸酶反應產生的粉紅色環(huán)帶色圍著一個紅色或蘭色菌落即為金黃色葡萄球菌，26小時可確認結果。培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術第7頁,共31頁，2024年2月25日，星期天螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀自動菌落計數儀第8頁,共31頁，2024年2月25日，星期天原理樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡。當用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時，菌液體積減少，注入的體積和瓊脂半徑間存在指數關系。培養(yǎng)時菌落沿注液線生長。用一計數的方格來校準與瓊脂表面不同區(qū)域有關的樣品量，計數每個區(qū)域的已知菌落數，在計算細菌濃度。螺旋平板法第9頁,共31頁，2024年2月25日，星期天平皿旋轉接種針往外移動同時自動將樣品稀釋1000倍阿基米德螺旋型軌跡螺旋平板法第10頁,共31頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋梯度，每個梯度倒2個平板，節(jié)省了大量人力物力。缺點檢測時間并沒有縮短，菌落總數仍需要培養(yǎng)48小時。需要配合自動菌落計數儀，否則人工計數更麻煩。螺旋平板法第11頁,共31頁，2024年2月25日，星期天濾膜法濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測。優(yōu)點靈敏度增大，菌落無擴散情況，便于計數。缺點需要額外的支出購買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對菌數要求特別嚴格的產品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。第12頁,共31頁，2024年2月25日，星期天ATP生物熒光法原理

ATP＋螢光素+螢光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光應用用于食品生產線和管道進行快速清潔程度檢測。用于水質檢測。改良后用于食品的商業(yè)無菌檢測或終產品檢驗。第13頁,共31頁，2024年2月25日，星期天10秒獲得結果涂抹采樣混合:震蕩5s檢測表面清潔度/水質檢測ATP生物熒光法第14頁,共31頁，2024年2月25日，星期天ATP法檢測成品的優(yōu)缺點優(yōu)點：大大縮短庫存時間，減少物流壓力和成本。缺點：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，有存在假陰性的可能。ATP生物熒光法第15頁,共31頁，2024年2月25日，星期天電阻抗法測定細菌總數原理

供細菌生長的液體培養(yǎng)基是電的良導體，在特制的測量管底部裝入電極插頭，即可對接種生長的培養(yǎng)基的阻抗變化進行檢測。阻抗變化的產生是由于微生物生長過程中的新陳代謝使培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物質(糖、脂類、蛋白質等）被分解成小分子代謝物，即較小的帶電離子（乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸或氨等）這些代謝產物的出現(xiàn)和聚集，增強了培養(yǎng)基的導電性能，從而降低了其阻抗值。第16頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

M=(R0-RT)/R0×100%

其中R0表示開始時培養(yǎng)基的阻抗值

RT表示任意時刻培養(yǎng)基的阻抗值

M表示培養(yǎng)基電阻減少的百分數。電阻越小細菌活動越多，在一定范圍內，菌落形成單位的對數Log(CFU)與IDT（阻抗檢測時間）呈直線關系。電阻抗法測定細菌總數第17頁,共31頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)缺點：電阻抗法較省力，樣品細菌數在4～18小時內出結果。但對于菌數太低的不好，樣品中還不能用防腐劑，否則結果是亂七八糟的。電阻抗法制作標準曲線過程中工作量較大，但以后的檢測簡便的多，不需要一系列稀釋，只需樣品1ml，培養(yǎng)基9ml，測量管一只。電阻抗法測定細菌總數第18頁,共31頁，2024年2月25日，星期天通過顏色變化檢測微生物生長導致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學檢測器檢測底部瓊脂層的顏色變化，記錄達到突變點的時間。與阻抗法類似，可以實現(xiàn)快速檢測。缺點：需要購買原廠的預裝培養(yǎng)基，應用范圍受限制，成本高昂。第19頁,共31頁，2024年2月25日，星期天梅里埃的BacT/Alert微生物檢測儀基于微生物生成產生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強度。光強度與微生物數量有一定關系。第20頁,共31頁，2024年2月25日，星期天流式細胞技術

原理液體樣品流過儀器中的激光照射的流動池，當微生物流過顯微鏡聚焦的流動池時就能被自動地檢測到。特點檢測方法與使用的儀器有高度的特異性，所以應遵循生產廠商提供的方法。

第21頁,共31頁，2024年2月25日，星期天FOSS公司BactoScanFC牛奶中總菌數快速檢測儀采用流式細胞原理。對微生物進行核酸染色，用流式細胞技術進行計數。優(yōu)點：速度快(50-150樣品/小時)缺點：死活細胞一起檢測，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細菌總數。流式細胞技術

第22頁,共31頁，2024年2月25日，星期天美國Chemunex公司微生物快速檢測系統(tǒng)將流式細胞技術與活細胞熒光探針標記及激光掃描技術相結合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測儀。其最大的特點是只檢測活細胞數，速度極快，處理量大。檢測步驟：1、過濾；2、標記，直接對活細胞和酵母進行標記；3、激光掃描。流式細胞技術

第23頁,共31頁，2024年2月25日，星期天三種型號的差異√√第24頁,共31頁，2024年2月25日，星期天利用細菌生長時產生熱量的原理設計而成。微生物在生長和代謝的過程中，能產生大量的代謝熱。由于各種微生物的代謝產物熱效應不同，因此可顯示出特異性的熱效應曲線圖。熱效應曲線圖的形成，是由于培養(yǎng)基含有多種成分，微生物則產生多種不同的代謝產物，以此表現(xiàn)出的熱效應為多個曲線峰，如為單一營養(yǎng)成分，則只有一個峰出現(xiàn)。在細菌生長的過程中，用微量量熱計測量產熱量等熱數據，經計算機處理，繪制成以產熱量對比時間組成的熱曲線圖，以此推斷細菌存在數量。微量量熱法第25頁,共31頁，2024年2月25日，星期天發(fā)射測量法利用細菌在代謝碳水化合物時產生CO2的原理，把微量的放射性標記引入葡萄糖或其他糖類分子中。細菌生長時，糖被利用并放出標記的CO2，將生成的放射性標記CO2從培養(yǎng)裝置中導出或用化學法吸收后，利用專用的放射測量儀來測定放射性CO2

。放射量與菌數成正比。第26頁,共31頁，2024年2月25日，星期天致病菌快速檢測方法顯色培養(yǎng)基法：技術成熟，產品很多。免疫學方法：產品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結果需要確認。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。分子生物學方法：以基因探針檢測法和PCR法為主?；蛐酒?7頁,共31頁，2024年2月25日，星期天顯色培養(yǎng)基法原理在選擇性培養(yǎng)基的基礎上經過改良。利用細菌特有的生理生化反應，使培養(yǎng)基中的指示劑產生顏色變化，以將目標菌與其他菌區(qū)別開來第28頁,共31頁，2024年2月25日，星期天酶聯(lián)免疫技術—mini-Vidas全自動免疫分析儀利用熒光分析技術通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結合，經充分沖洗，通過激發(fā)光源檢測，即能自動讀出發(fā)光的陽性標本。優(yōu)點是檢測靈敏度高，速度快，可以在48小時的時間內快速鑒定沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、單核李斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。第29頁,共31頁，2024年2月25日，星期天分子生物學方法基因探針法及PCR方法在國外已經有相當成