土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

關于土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)課題背景：1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3脲酶第2頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目㈢.設置對照第3頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

1、實例：DNA多聚酶鏈式反應是一種在體外將少量DNA大量復制的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。美國微生物學家布魯克于1996年在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現(xiàn)的Taq細菌中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶第4頁,共49頁，2024年2月25日，星期天原因：因為熱泉溫度70～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細菌被篩選出來。啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。為什么Taq細菌能從熱泉中被篩選出來呢?第5頁,共49頁，2024年2月25日，星期天2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。第6頁,共49頁，2024年2月25日，星期天15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基第7頁,共49頁，2024年2月25日，星期天②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素有，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源,才能在該培養(yǎng)基上生長。5、請你分析該培養(yǎng)基的配方,想一想這種培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用?如具有,是如何進行選擇的?第8頁,共49頁，2024年2月25日，星期天1、顯微鏡直接計數(shù)：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點第9頁,共49頁，2024年2月25日，星期天公式：觀察到的紅細胞平均數(shù)觀察到的細菌平均數(shù)紅細胞含量細菌含量=第10頁,共49頁，2024年2月25日，星期天2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。第11頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共49頁，2024年2月25日，星期天設置重復組的重要性：第一位同學只涂布了一個平板，沒有設置重復組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學考慮到設置重復組的問題，涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。這個實例啟示學生，在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮所設置的重復組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。第13頁,共49頁，2024年2月25日，星期天注意事項①為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。第14頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

1.想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？答：統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進行計算。第15頁,共49頁，2024年2月25日，星期天（三）設置對照。。第16頁,共49頁，2024年2月25日，星期天小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設置是必不可少的。方案一：其他同學用與A同學相同土樣進行實驗方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。方案三:培養(yǎng)基滅菌后接種不能分解尿素的微生物,觀察有無菌落生成,如有,說明培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)結(jié)果預測：如果結(jié)果與A同學一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學的培養(yǎng)基被雜菌污染了或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)。第17頁,共49頁，2024年2月25日，星期天二.實驗設計

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。土壤微生物種類最多、數(shù)量最大的原因是什么？土壤中營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，環(huán)境條件適宜第18頁,共49頁，2024年2月25日，星期天◆應在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進行[三]樣品的稀釋第19頁,共49頁，2024年2月25日，星期天為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。第20頁,共49頁，2024年2月25日，星期天㈣.取樣涂布◆實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。◆如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。第21頁,共49頁，2024年2月25日，星期天㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。菌落的特征包括形狀、大小、隆起程度、顏色等方面第22頁,共49頁，2024年2月25日，星期天微生物的培養(yǎng)與觀察第23頁,共49頁，2024年2月25日，星期天操作提示[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]規(guī)劃時間第24頁,共49頁，2024年2月25日，星期天三.結(jié)果分析與評價1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30—300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。第25頁,共49頁，2024年2月25日，星期天五.課外延伸在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。第26頁,共49頁，2024年2月25日，星期天課題延伸CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3脲酶pH升高指示劑（酚紅）將變紅第27頁,共49頁，2024年2月25日，星期天測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。第28頁,共49頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌呈黑色中心,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征

第29頁,共49頁，2024年2月25日，星期天本課題知識小結(jié):第30頁,共49頁，2024年2月25日，星期天1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實踐訓練CD第31頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3.下列說法不正確的是（）

A.科學家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值

C.設置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。4.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）

A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì)

C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽BC第32頁,共49頁，2024年2月25日，星期天(2008年高考廣東卷)苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界中存在著降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中篩選獲得了只能降解利用苯酚的細菌菌株。篩選的主要步驟如下圖所示：①為土壤樣品。請回答下列問題：(1)②中培養(yǎng)目的菌株的選擇培養(yǎng)基中應加入作為碳源。②中不同濃度碳源的培養(yǎng)基______(A.影響；B.不影響)細菌的數(shù)量。如果要測定②中活細菌數(shù)量，常采用法。苯酚A稀釋涂布平板第33頁,共49頁，2024年2月25日，星期天(2)④為對照，微生物在④中不生長、在⑤中生長。④與⑤培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于；使用________法可以在⑥上獲得單菌落。采用固體平板培養(yǎng)細菌時為什么進行倒置培養(yǎng)？(3)如何比較不同菌株降解苯酚能力的大??？④不含苯酚，⑤以苯酚為唯一碳源平板劃線避免培養(yǎng)過程產(chǎn)生的水分影響微生物的生用同樣苯酚濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)不同菌株，一定時間后，測定培養(yǎng)液中苯酚含量第34頁,共49頁，2024年2月25日，星期天請根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。例：下面是分離分解尿素的細菌所用的培養(yǎng)基配方第35頁,共49頁，2024年2月25日，星期天請根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。4例：下面是分離分解尿素的細菌所用的培養(yǎng)基配方第36頁,共49頁，2024年2月25日，星期天請根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。4葡萄糖例：下面是分離分解尿素的細菌所用的培養(yǎng)基配方第37頁,共49頁，2024年2月25日，星期天請根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。4葡萄糖尿素例：下面是分離分解尿素的細菌所用的培養(yǎng)基配方第38頁,共49頁，2024年2月25日，星期天請根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。4葡萄糖尿素固體例：下面是分離分解尿素的細菌所用的培養(yǎng)基配方第39頁,共49頁，2024年2月25日，星期天請根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。4葡萄糖尿素固體選擇例：下面是分離分解尿素的細菌所用的培養(yǎng)基配方第40頁,共49頁，2024年2月25日，星期天(3)該培養(yǎng)基具有選擇作用的原因是

。例：下面是分離分解尿素的細菌所用的培養(yǎng)基配方第41頁,共49頁，2024年2月25日，星期天(3)該培養(yǎng)基具有選擇作用的原因是

。該培養(yǎng)基中，唯一的氮源是尿素，只有能分解尿素的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長和繁殖例：下面是分離分解尿素的細菌所用的培養(yǎng)基配方第42頁,共49頁，2024年2月25日，星期天(4)該培養(yǎng)基中，可通過檢測pH的變化來判斷尿素是否被分解，依據(jù)的原理是

。例：下面是分離分解尿素的細菌所用的培養(yǎng)基配方第43頁,共49頁，2024年2月25日，星期天(4)該培養(yǎng)基