分子雜交技術(shù)

關(guān)于分子雜交技術(shù)第一節(jié)分子雜交的原理核酸分子雜交（nucleicacidhybridization）指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過程。分子雜交是通過配對(duì)堿基對(duì)之間的非共價(jià)鍵（主要是氫鍵）結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈

第2頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同來源的DNA或RNA單鏈在一定條件下重新組成的新的雙鏈分子——雜交分子若所用的核酸探針的片段較長(zhǎng)(幾百個(gè)核苷酸以上)，可以得到很準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。但若人工合成的寡核苷酸探針片段較短（如20～30個(gè)核苷酸），則難免會(huì)出現(xiàn)準(zhǔn)確性差的假陽(yáng)性現(xiàn)象。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。第3頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天雜交的雙方：探針和要檢測(cè)的核酸。將核酸分子固定在固相支持物上，然后用標(biāo)記的探針和被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。被檢測(cè)的核酸：

克隆化的基因組DNA

提純的

細(xì)胞總DNA

細(xì)胞內(nèi)雜交（細(xì)胞原位雜交）

細(xì)胞總RNA第4頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天變性復(fù)性

DNA-DNA雜交雙鏈分子第5頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天雜交過程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。第6頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、DNA變性與復(fù)性（一）DNA變性

1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性2、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時(shí)，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時(shí)，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。第7頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天GC含量與Tm值之間的關(guān)系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3第8頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）復(fù)性

1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。第9頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對(duì)，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子第10頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天二.分子雜交的一般程序

待測(cè)核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未參與雜交的探針檢測(cè)雜交信號(hào)制備探針核酸片段探針標(biāo)記加入標(biāo)記核酸探針電泳第11頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天制備DNA或RNA樣品→與固定基質(zhì)結(jié)合→80℃真空固定→預(yù)雜交→加入標(biāo)記探針雜交→洗滌→放射自顯影或顯色反應(yīng)。第12頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、

核酸探針的制備探針（Probe)的概念:

一段帶有檢測(cè)標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。第13頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.探針的制備方法長(zhǎng)度一般以50~300bp為宜，有時(shí)達(dá)1.5kb。制備方法：

(1)DNA重組技術(shù)

(2)PCR擴(kuò)增

(3)化學(xué)合成第14頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.探針的分類

據(jù)來源及性質(zhì)不同可分為：

(1)基因組DNA探針

(2)cDNA探針

(3)RNA探針

(4)寡核苷酸探針第15頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天合成寡核苷酸探針注意原則(1)長(zhǎng)度（10-50bp);(2)G:C對(duì)含量40%-60%；(3)探針內(nèi)避免互補(bǔ)；(4)避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5)與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。第16頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.核酸探針的標(biāo)記

為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào)。第17頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

標(biāo)記的種類

同位素：

32P、35S、3H、125I等標(biāo)記探針非同位素：生物素、地高辛配體、熒光素等作為標(biāo)記物

第18頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)核酸分子雜交的方法按其分子種類劃分（1）Southern印跡雜交（2）Northern印跡雜交3）Western印跡雜交第19頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天按待測(cè)核酸是否固定在固相支持物上分：固-液相雜交膜上印跡雜交原位雜交液相雜交

RNA酶保護(hù)分析法核酸酶S1保護(hù)分析法第20頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、Southern雜交其基本原理是將待檢測(cè)的DNA樣品固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號(hào)。通過Southern雜交可以判斷被檢測(cè)的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長(zhǎng)度。DNA經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對(duì)象為DNA，探針為DNA或RNA。利用這一技術(shù)可進(jìn)行克隆基因DNA的酶切圖譜分析，基因組中某一基因的定性與定量分析、基因點(diǎn)突變及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分性等。

第21頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天步驟：酶切DNA,凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。(2)將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。

(3)預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。(4)讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。

(5)通過顯影檢查目的DNA所在的位置。

第22頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程第23頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）待測(cè)核酸樣品的制備

1、裂解或破碎細(xì)胞

2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段第24頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）待測(cè)DNA樣品的電泳分離所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記，雜交后的標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA也能顯影出條帶。第25頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（三）凝膠中核酸的變性（堿變性）

分子量超過10kb的較大的DNA片段，需要很長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移時(shí)間。必須將最長(zhǎng)的DNA片段控制在大約2kb以下。如果靶序列>5kb，則需進(jìn)行脫嘌呤處理（DNA產(chǎn)生缺口將提高轉(zhuǎn)移的質(zhì)量）。把凝膠浸在0.25mol/LHCl中，室溫輕輕晃動(dòng)，直到溴酚藍(lán)從藍(lán)變黃。注意：處理人類基因組DNA≤10分鐘；處理植物基因組DNA≤20分鐘。再

把凝膠浸在滅菌雙蒸水中第26頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天如果靶序列<5kb，則直接進(jìn)行下面的步驟(1)把凝膠浸在變性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室溫2×15分鐘，輕輕晃動(dòng)。(2)把凝膠浸在滅菌雙蒸水中(3)把凝膠浸在中和液中（0.5mol/LTris-HCl，Ph7.5，1.5mol/LNaCl），室溫2×15分鐘。(4)在20×SSC中平衡凝膠至少10分鐘。第27頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）Southern印跡高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜（尼龍膜也較長(zhǎng)用）上，烘干固定后即可用于雜交本方法由Southern發(fā)明,故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)第28頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）毛細(xì)管虹吸印跡法

利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上第29頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天第30頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天白瓷盤玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉(zhuǎn)膜第31頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單,不需要用其他儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng),轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱第32頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。第33頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天第34頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號(hào)比Southern轉(zhuǎn)移強(qiáng)2-3倍。缺點(diǎn)是如不小心，會(huì)使凝膠碎裂,并且在洗膜不嚴(yán)格時(shí),其背景比毛細(xì)轉(zhuǎn)移要高。

第35頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）電轉(zhuǎn)法利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。該法的優(yōu)點(diǎn)是不需要脫嘌呤/水解作用,可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無效時(shí),才采用電泳轉(zhuǎn)移。第36頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天（五）Southern雜交1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)

將固定于膜上的DNA片段與探針進(jìn)行雜交之前，必須先進(jìn)行一個(gè)預(yù)雜交的過程。因?yàn)槟芙Y(jié)合DNA片段的膜同樣能夠結(jié)合探針DNA，在進(jìn)行雜交前，必須將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部封閉，這就是預(yù)雜交的目的。第37頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天預(yù)雜交是將轉(zhuǎn)印后的濾膜置于一個(gè)浸泡在水浴搖床的封閉塑料袋中進(jìn)行，袋中裝有預(yù)雜交液，使預(yù)雜交液不斷在膜上流動(dòng)。預(yù)雜交液實(shí)際上就是不含探針的雜交液，但其中主要含有鮭魚精子DNA（該DNA與哺乳動(dòng)物的同源性極低，不會(huì)與DNA探針DNA雜交）、牛血清等，這些大分子可以封閉膜上所有非特異性吸附位點(diǎn)第38頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交轉(zhuǎn)印后的濾膜在預(yù)雜交液中溫育4-6h，即可加入標(biāo)記的探針DNA，即可進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交是在相對(duì)高離子強(qiáng)度的緩沖鹽溶液中進(jìn)行。離子強(qiáng)度越低，溫度越高，雜交的嚴(yán)格程度越高，也就是說，只有探針和待測(cè)順序之間有非常高的同源性時(shí)，才能在低鹽高溫的雜交條件下結(jié)合。雜交過夜（至少18h），然后在較高溫度下用鹽溶液洗膜。

第39頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA在洗膜過程中，要不斷振蕩，不斷用放射性檢測(cè)儀探測(cè)膜上的放射強(qiáng)度。當(dāng)放射強(qiáng)度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時(shí)，即停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水分，并用保鮮膜包裹。注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。第40頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天（六）雜交結(jié)果檢測(cè)

1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針（一）將濾膜正面向上，放入暗盒中。將2張X光底片放入曝光暗盒，（二）將暗盒置-70℃低溫冰箱中使濾膜對(duì)X光底片曝光（根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱決定曝光時(shí)間，一般在1-3天）。（三）從冰箱中取出暗盒，置室溫1-2h，使其溫度上升至室溫，然后沖洗X光底片（洗片時(shí)先洗一張，若感光偏弱，則在多加兩天曝光時(shí)間，再洗第二張片子）。

2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針第41頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天Southern雜交能否檢出雜交信號(hào)取決于：目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量探針與目的DNA間的配對(duì)情況等。在最佳條件下,放射自顯影曝光數(shù)天后,Southern雜交能很靈敏地檢測(cè)出低于0.1pg與32P標(biāo)記的高比活性探針的(>109cpm/μg)互補(bǔ)DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長(zhǎng)度為幾百個(gè)核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測(cè)出哺乳動(dòng)物基因組中1kb大小的單拷貝序列。

第42頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、酶切圖譜分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突變分析

4、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分析第43頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、Northern印跡雜交原理：Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標(biāo)記的DNA或RNA探針，依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行放射自顯影（或化學(xué)顯影），以目標(biāo)RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強(qiáng)度則可提示目標(biāo)RNA在所測(cè)樣品中的相對(duì)含量（即目標(biāo)RNA的豐度）。第44頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1、鑒別RNA2、探針可用DNA或RNA片段

3、待測(cè)樣品為總RNA或mRNA第45頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天Northern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)1.總RNA不需要進(jìn)行酶切，即是以各個(gè)RNA分子的形式存在，可直接應(yīng)用于電泳；

2、變性：RNA電泳前加熱變性，電泳在變性條件下進(jìn)行,以去除RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu),保證RNA完