腫瘤血管生成及其檢測

腫瘤血管生成及其檢測

人體腫瘤大部分為實體瘤(solidtumors)。實體瘤瘤組織由瘤細胞和間質構成，后者主要包括血管、淋巴管、結締組織、炎細胞及細胞外基質等成分。其中，血管和結締組織起營養(yǎng)、支持瘤細胞的作用。第2頁,共64頁，2024年2月25日，星期天腫瘤內的新生血管和淋巴管分別通過血管生成(angiogenesis)和淋巴管生成(1ymphangiogenesis)實現(xiàn)的，并在腫瘤的生長和擴散(侵襲和轉移)中起重要作用。已有研究證明，腫瘤血管生成活躍程度對組織病理分級、放射治療以及在預后判斷上都有重要的評估價值。

第3頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)腫瘤血管生成的基本過程一、血管生成現(xiàn)象(一)血管生成的概念1945年Algire提出了“腫瘤血管生成(tumorangiogenesis)”或“血管新生化(neovasclarzation)”概念。對血管生成重要性的認識，特別是提出“腫瘤生長依賴于血管生成”觀點，始于1971年Folkman對腫瘤血管生成的研究報道。

第4頁,共64頁，2024年2月25日，星期天血管生成是指活體組織在已存在的微血管床上芽生(sprouting)出新的以毛細血管為主的血管系統(tǒng)的過程。有別于胚胎時期由早期內皮細胞分化形成新血管的過程即血管形成(vasculogenesis)

(二)血管生成的研究方法雞胚絨毛尿囊膜試驗角膜移植實驗第5頁,共64頁，2024年2月25日，星期天開窗實驗動物移植瘤等在體模型三維膠分析法細胞聯(lián)合培養(yǎng)等離體模型

識別內皮細胞的免疫學標記物

:第8因子相關抗原(factorⅧrelatedantigenFⅧAg)、CD3l、CD34、CDl05

血管生成因子:VEGF及其受體家族FGF家族及其受體

Ang和Tie受體家族Angiotropin血小板源內皮細胞生長因子(PD-ECGF)

第6頁,共64頁，2024年2月25日，星期天二．腫瘤血管生成的基本過程(一)血管生成的基本過程血管生成的基本步驟是①血管生成因子的產生過多使之與抑制因子失衡，導致內皮細胞激活，產生血管生成表型；②血管部位細胞外基質改變、基底膜降解，內皮細胞芽生、增殖和遷移；第7頁,共64頁，2024年2月25日，星期天③新生內皮細胞索形成管狀毛細血管襻及管腔；④新生血管管腔的貫通。內皮細胞凋亡、脫離基底膜和血管壁細胞改變可能是血管消退的主要病理學事件。(二)腫瘤血管生成的過程1．腫瘤生長的階段性

①無血管期(avascularphase)或稱血管前期(prevascularphase)

腫瘤直徑不超過1～2mm

第8頁,共64頁，2024年2月25日，星期天②血管期(vascularphase)

腫瘤迅速生長并發(fā)生轉移

2.腫瘤血管的起源腫瘤中的血管可能有3種來源：①血管生成:以兩種方式發(fā)生,一是腫瘤細胞團先處于無血管期生長，后因缺氧而產生大量血管生成因子，從而誘導血管生成；另一種是瘤細胞先依賴宿主組織已存在的血管生長，繼而出現(xiàn)瘤內血管消退，然后再因缺氧誘導血管生成因子作用而發(fā)生血管生成

②血管套疊性生長第9頁,共64頁，2024年2月25日，星期天③內皮祖細胞3．腫瘤血管生成的過程

瘤細胞和巨噬細胞血管生成因子(VEGF等)

小血管毛細血管伸展內皮細胞遷移形成毛細血管芽新生毛細血管形成并連通第10頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)腫瘤微血管形態(tài)和生物學特性腫瘤微血管不僅在形態(tài)上不同于正常血管，而且在生物學功能上也有其特殊性。一．腫瘤微血管形態(tài)表現(xiàn)腫瘤組織內新生的微血管一般遍布整個腫瘤組織，但分布上并不均一。血管生成最活躍、微血管密度最高的區(qū)域被稱為所謂“血管熱點區(qū)”(hotspots)，這也是進行腫瘤微血管密度測定的選擇區(qū)域。很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長活躍的邊緣。第11頁,共64頁，2024年2月25日，星期天腫瘤的新生血管分布上常常無規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，可表現(xiàn)為狹窄、擴張或扭曲。新生血管呈血竇狀、條索狀，管壁薄，甚至僅有一層內皮細胞；或管壁很厚，但結構上仍然不完善。內皮細胞～般比較幼稚，細胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時血管外的腫瘤細胞可直接與血管管腔相連。腫瘤血管的結構缺陷是這些血管具有高通透性的結構基礎，也是腫瘤轉移途徑之一。

第12頁,共64頁，2024年2月25日，星期天不同類型腫瘤間質的血管沒有本質區(qū)別，但在形態(tài)和數量上卻有不同。生長活躍的惡性腫瘤常富于血管．如內分泌腫瘤．腎癌、骨肉瘤、絨毛膜癌、破骨細胞瘤、膠質母細胞瘤和肝細胞癌等，而硬癌、軟骨瘤和軟骨肉瘤中血管甚少。不同腫瘤血管的形態(tài)又有一定的差異，如膠質母細胞瘤中新生血管不僅豐富，而且內皮細胞呈不同程度的增生、肥大；絨毛膜癌、肝細胞癌等血管呈壁薄、明顯擴張的血竇。第13頁,共64頁，2024年2月25日，星期天以惡性膠質瘤為例，腫瘤組織內新生血管的主要表現(xiàn)形式有:①梭形內皮細胞呈索狀排列，枝狀分布，有或無明顯的血管腔，呈原始、幼稚的微血管②內皮細胞增生、肥大，管腔狹小，呈現(xiàn)厚壁血管③內皮細胞增生，形成球形血管壁內血管．呈現(xiàn)“腎小球樣結構”；④管腔大、管壁較薄的相對較大的微血管，并形成血管心假菊形團結構；⑤大量管壁退變和鈣化的新生血管；第14頁,共64頁，2024年2月25日，星期天⑥增生血管叢呈蛇形密集排列，形成腫瘤與瘤周組織間的血管屏障；⑦血管內皮區(qū)域性極度增生，呈片狀的梭形細胞，構成“假肉瘤化”。二、腫瘤微血管的生物學特性①低反應性②高通透性③低供氧能力

第15頁,共64頁，2024年2月25日，星期天最近，VogelsteinB和KinzlerKW采用基因表達的系列分析(serialanalysisofgeneexpressionSAGE)方法，比較研究了結直腸癌和正常腸黏膜血管內皮細胞的基因表達差異。結果發(fā)現(xiàn)．二者基因表達存在差異。他們得到了79種差異表達的轉錄子，其中TEM8僅表達于腫瘤內皮而不表達于黃體形成中的內皮細胞，提示腫瘤血管生成和生理狀態(tài)下的血管生成有明顯不同。這一發(fā)現(xiàn)為血管生成的基礎和臨床研究提供了重要資料，也引起了血管生成和腫瘤治療研究者的重視。

第16頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)腫瘤血管生成的調控機制腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的調控。腫瘤細胞、內皮細胞和巨噬細胞受缺氧刺激等使局部微環(huán)境發(fā)生變化的因素作用而合成和釋放大量血管生成因子從不同環(huán)節(jié)促進血管生成。組織中同時也存在內源性血管生成抑制因子，對血管生成起抑制作用。

第17頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

一、血管生成因子血管生成的始動需要血管生成因子。一系列血管生成因子、細胞因子、細胞外基質和黏附分子及其抑制物，以及代謝性和機械性因子均參與了血管生成過程。已知的血管生成因子有數十種，其中VEGF和Ang家族是已知的、特異性作用于內皮細胞的生長因子，在血管生成中作用可能也是最為重要的。第18頁,共64頁，2024年2月25日，星期天(一)VEGF及其受體家族

1．VEGF家族及其愛體VEGF又稱血管通透性因子(vascularpermeabilityfactor,VPF)，為分子量34~45kD的同源二聚體糖蛋白，屬于堿性蛋白。VEGF基因通過轉錄水平的剪切，可產生5種變異體，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和VEGFl21，分別由206、189、165、145和121個氨基酸組成。第19頁,共64頁，2024年2月25日，星期天其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均為可溶性分泌蛋白，擴散力強，易于到達靶細胞。近年又發(fā)現(xiàn)其他一些與VEGF功能相似、結構上有一定同源性的多肽因子，包括胎盤生長因子(placentorgrowthfactor，PIGF)，VEGF-B(VEGF相關因子，VEGF-relatedfactor，VRF)，VEGF-C(VEGF相關蛋白，VEGF-relatedprotein，VRP)，以及VEGF-D／FIGF和VEGF-E等成員，它們共同構成VEGF家族

第20頁,共64頁，2024年2月25日，星期天VEGF受體包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1／KDR)和VEGFR-3(Flt-4)

2．VEGF及其受體的作用

:早期血管的形成需要VEGF的調節(jié)，它們與內皮細胞上相應的酪氨酸激酶受體結合，引起內皮細胞分裂和分化，并形成管腔樣結構。在胚胎發(fā)育過程中，VEGF(主要是VEGF-A)通過其受體VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1／KDR)促進內皮分化、增殖、遷移和原始血管形成.

第21頁,共64頁，2024年2月25日，星期天由新形成的內皮組裝成管腔樣結構需要VEGFR-1的表達和激活，而VEGFR-3的表達與內皮細胞形成靜脈或淋巴管有關。VEGF不僅是內皮細胞特異的強效有絲分裂原，而且能促進內皮細胞產生并調節(jié)纖溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中發(fā)揮重要作用。VEGF在幾乎所有的人體腫瘤和腫瘤細胞株中皆有過表達。VEGF及其受體在腫瘤中的表達常與腫瘤分化程度密切相關。

第22頁,共64頁，2024年2月25日，星期天大多數實體瘤VEGF基因均有過表達，VEGF165VEGF121兩種VEGF最常見。

在VEGF家族中，VEGF-C和VEG-D既可誘導血管生成，又可誘導淋巴管生成。已有研究報道，人體多種腫瘤細胞高表達VEGF-C。體內轉基因實驗也證實，腫瘤細胞VEGF-C的高表達能選擇性地誘導腫瘤組織淋巴管生成。腫瘤組織中的VEGF-C和VEGF-D還來源于浸潤的巨噬細胞。

第23頁,共64頁，2024年2月25日，星期天缺氧是包括膠質瘤細胞在內的許多細胞系產生VEGF的一個強烈的誘導因子

離體條件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表達的誘因。VEGF在腫瘤壞死灶周邊常呈強表達。腫瘤中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達水平常與VEGF呈正相關，NO與VEGF之間具有相互調節(jié)作用。多種癌基因的激活通過上調VEGF表達而誘導血管生成，失活的抑癌基因(如突變型p53基因)也參與了VEGF介導的血管生成過程。

第24頁,共64頁，2024年2月25日，星期天(二)FGF家族及其受體1．FGF家族目前研究最為深入的是堿性戒纖維細胞生長因子(bFGF)和酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)。bFGF和aFGF在結構上是相關的，二者之間有53％的序列同源。

2．FGF的分布和生物學作用bFGF是體內分布廣泛的生長因子之一，可在不同腫瘤中表達，包括膀胱癌、神經膠質瘤、肝癌、胃腸癌、乳腺癌、腎細胞癌和甲狀腺癌等許多培養(yǎng)的細胞系都可以合成它。

第25頁,共64頁，2024年2月25日，星期天其功能具有多樣性，可促進內皮細胞的有絲分裂、趨化性和遷移，刺激內皮細胞產生膠原酶降解基底膜，誘導來源于中胚層和神經外胚層細胞的增殖和分化。bFGF也表現(xiàn)出親神經性行為，促進神經元的存活和分化。

bFGF和aFGF均與肝素有很強的親和力，研究表明這種高親和力對于FGF與細胞表達的受體結合是非常重要的。

第26頁,共64頁，2024年2月25日，星期天3．FGF受體bFGF的生物學作用是通過與其特異性的細胞表面受體FGF受體(FGFreceptors，F(xiàn)GFR)結合而介導實現(xiàn)的。已經識別4種FGFR，包括FGFR-1(flg)、FGFR-2(bek)、FGFR-3和FGFR-4。FGFR-1在bFGF／FGFR系統(tǒng)中的作用最大。正常腦神經元和膠質細胞中FGFR-1的表達呈現(xiàn)明顯的異質性，即組織中有些細胞呈現(xiàn)FGFR-1陽性，有些則顯示陰性；血管內皮細胞亦是如此。

第27頁,共64頁，2024年2月25日，星期天(三)

Angiotropin

AngiOtropin是一個含銅離子的4．5kD核酸與多肽的聚合物。將angiotropin加入到已匯合的毛細血管內皮細胞培養(yǎng)基中，它以劑量依賴方式刺激內皮遷移并快速排列成管樣結構，這種效應對內皮細胞是特異的。由于它是巨噬細胞產生的化學調節(jié)劑，所以它可能啟動炎癥和傷口愈合中的血管生成過程。第28頁,共64頁，2024年2月25日，星期天（四）血小板源內皮細胞生長因子(PD-ECGF)

PD-ECGF是一個酸性45kD單鏈多肽。它是內皮細胞特異的有絲分裂素，能刺激人和豬的內皮細胞增生。用PD-ECGF轉染腫瘤細胞，其裸鼠移植瘤血管密度明顯增加。(五)其他血管生成因子Ang和Tie受體家族

EGFTGF粒細胞集落刺激因子／粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(G-CSF／GM—CSF)第29頁,共64頁，2024年2月25日，星期天(七)降解基底膜的相關物質血管基底膜的降解是血管生成過程中的重要事件，只有基底膜降解之后，內皮細胞才能遷移入周圍組織并形成血管芽?；啄さ慕到馐且粡碗s過程，涉及一系列酶的作用，這些酶包括基質金屬蛋白溶酶、尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子(urokinase-typeplasminogen,u-PA)；絲氨酸蛋白酶(serineproteases)、細胞外蛋白體(proteasome)、糖苷酶(endoglycosidases)、組織蛋白酶(cathepsins)和多形核白細胞絲氨酸蛋白酶(serineproteinase)。

第30頁,共64頁，2024年2月25日，星期天u-PA的作用涉及腫瘤的血管生成與侵襲過程。U-PA使纖維蛋白溶酶原轉為纖維蛋白溶酶,后者能降解基質蛋白并激和幾種基質金屬蛋白酶。(八)細胞外基質和基質黏附受體在血管生成型中不但需要細胞因子與相應受體的結合，細胞外基質(extraceIlularmatrix,ECM)也起著重要作用。

內皮細胞獨自在接受生長因子的刺激時只表現(xiàn)增生，而在有細胞外基質的條件下，內皮細胞才能形成管腔樣結構。

第31頁,共64頁，2024年2月25日，星期天二、缺氧對血管生成的誘導作用缺氧是腫瘤和非腫瘤性疾病血管生成的重要刺激因素。缺氧誘導的相關轉錄因子包括缺氧誘導因子-1、-2(hypoxiainducingfactor-l，-2，HIF-1．HIF-2)和NF-КB,其中以HIF-l在血管生成中的作用最為重要。

在腫瘤組織中，缺氧一方面可導致瘤細胞死亡，另一方面也刺激殘留瘤細胞上調血管生成因子的表達。

第32頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

第四節(jié)血管生成的有關檢測方法一.腫瘤血管生成的體內研究動物模型

腫瘤血管生成體內研究的生物試驗模型主要有動物(大鼠，兔等)眼角膜囊(眼前房)、地鼠頰囊、裸鼠外耳皮下和雞胚絨毛尿囊膜(CAM)等四種動物模型。國內學者對這四種模型均有研究。有研究認為CAM是研究血管生成較好的實驗模型，其方法簡便二成本低，儀器設備條件要求不高，易于操作，便于推廣；并可用于進行大樣本研究，或用于影響血管生成的因素或藥物的篩選和評價。因此，特將CAM試驗方法作簡單介紹：

第33頁,共64頁，2024年2月25日，星期天雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗:(1)．雞胚準備和接種組織：選擇北京白雞種蛋，洗凈，用l：1000苯扎溴銨(新潔爾滅)液浸泡3分鐘，置37．8土0．5℃培養(yǎng)箱中孵育。雞胚發(fā)育第7天，蛋殼消毒后，標記制作2cmX3cm左右觀察窗。接種組織視研究目的而定，一定要在接種當日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成1～2mm組織小塊。(2)組織接種：在制備雞胚觀察窗的次日，即雞胚發(fā)育第8天進行組織接種。每個雞胚可接種5—7個組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。

第34頁,共64頁，2024年2月25日，星期天(3)接種組織的收獲與觀察：組織接種后每12小時觀察一次，到組織接種第11天(雞胚發(fā)育第18天)收獲接種組織，取出雞胚，置接種組織連同周圍的CAM于解剖顯微鏡下觀察，并用10％甲醛固定保存，部分組織可作石蠟切片，用作血管生成研究的免疫組化染色等。

(4)CAM的血管生成表現(xiàn)：組織接種24小時后，CAM血管開始向接種組織生長，隨培養(yǎng)時間的延長，血管數目及直徑均明顯增加；第2天，新細小血管直接趨向組織；第35頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

第3天，新生血管形成以接種組織為中心，10～20條放射狀血管網；爾后，CAM血管繼續(xù)明顯增加。非接種部位與接種部位比較，CAM血管數目少，大血管與小血管呈脈樣均勻分布；而接種部位的CAM血管在接種組織周圍彌散樣增加，以組織為中心向周圍呈放射狀分布，在首先與組織發(fā)生聯(lián)系的區(qū)域CAM血管更多。第4天，可見新生細小CAM血管生長形成中、粗血管，并在中、粗血管繼續(xù)分支出細小血管，形成新的血管網。CAM血管管腔結構清晰，可區(qū)別動、靜脈。

第36頁,共64頁，2024年2月25日，星期天(5)CAM血管生成實驗模型的用途：CAM血管生成模型用于血管生成的研究，可取得兩方面結果：①檢測評價接種物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析研究血管生成促進因子、抑制因子的活性和作用的檢測，如腫瘤血管生成的研究等；②對接種物，如腫瘤組織、自身的血管生成進行研究，用于分析不同組織的血管生成活性和作用，如腫瘤組織有引發(fā)新生血管生成的作用.第37頁,共64頁，2024年2月25日，星期天對照抗血管生成藥物作用以后第38頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

盡管血管生成的體內動物模型研究更為接近人體的生理狀態(tài)，使研究結果更為可靠，但Kathryn等認為仍有一些不足之處，如操作繁瑣，耗時過長；另外，在該類模型中，血管生成物必須植入眼角膜囊、頰囊、或絨毛尿膜囊使之誘導血管生成，難免產生人為因素誘導的血管生成；血管生成促進因子、抑制因子等需要從多聚載體中釋放出來；操作方法和測定其結果的技術較為復雜。由于這些不利之處，最近，Kathryn等又建立了一種新的血管生成模型:二.人胎盤血管培養(yǎng)實驗(體外)

Kathryn等認為不但既往的體內血管生成實驗研究模型有上述不足之處，而體外的血管生成實驗研究也主要是內皮細胞的長期培養(yǎng)，將內皮細胞置于細胞外基質環(huán)境，或者暴露于各種血管生成刺激因子，使之誘導其血管形成。

第39頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

該類體外實驗研究，有很多人為因素影響，不能代表體內生理反應，因為內皮細胞在生長因子存在的條件下培養(yǎng)了很長一段時間，已被激活。因此，有必要建立一類與體內生理反應有關的血管生成實驗方法，尤其是與人類血管生成有關的血管生成實驗。

于是，Kathryn等建立了一種新的人血管生成模型。從自愿選擇剖腹產手術24小時之內的人胎盤頂端表面截取約長2～5cm，直徑為l～2mm的表淺血管，洗去血污，浸入Hank平衡鹽溶液中。

第40頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

培養(yǎng)在48孔培養(yǎng)板中進行，可在孔中分別加入各種血管生成因子，再加l99培養(yǎng)基，將血管片段在凝固前迅速加入培養(yǎng)孔中央，理想的是使血管片段懸浮于培養(yǎng)膠中。然后將培養(yǎng)板置37℃保濕孵育培養(yǎng)14～21天，每周換培養(yǎng)基2次。用減數成相系統(tǒng)計；算原來血管條生成的血管索數量，每隔一天計數新生長形成的微血管條數，由此描繪微血管生長曲線。第41頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

用免疫組化、流式細胞儀、電鏡等分別檢測了CD34，Weibel-Palade小體標志物等，證實新生血管中含有內皮細胞。該實驗模型不需要加外源性生長因子，并用該模型檢測研究了aFGF、bFGF，三種VEGF異構體及其受體在原代血管生長及子代新生血管形成中的作用。結果表明該模型是篩選人類血管生成潛在激活增強因子和抑制因子行之有效的體外實驗模型。

第42頁,共64頁，2024年2月25日，星期天三.腫瘤微血管密度計數(MVD)

用FⅧ因子單克隆抗體在組織切片上進行免疫組織化學染色

,血管內皮細胞呈棕黃色。

MVD計數按Weidner等的方法并加以改動，先在低倍視野內找到MVD最高的區(qū)域，然后在高倍視野內計數微血管的數目。分辨不清或染色模糊的細胞不計入結果，單個的棕黃色內皮細胞或細胞簇作一個血管計數，但肌層較厚及血管腔面積>8個紅細胞直徑的血管不計數。計5個視野的IMVD，取其平均值作為IMVD。第43頁,共64頁，2024年2月25日，星期天四.腫瘤血管生成調控因子的檢測以VEGF為例,根據實驗條件和需要可以從蛋白質水平或核酸水平進行檢測:(一)免疫組織化學檢測用VEGF單克隆抗體在組織切片或細胞爬片上進行免疫組織化學染色

,

腫瘤細胞胞漿呈棕黃色。第44頁,共64頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)的子宮內膜癌細胞VEGF陽性表達第45頁,共64頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)的腦星形細胞瘤細胞VEGF陽性表達第46頁,共64頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)的腦星形細胞瘤細胞VEGF陽性表達第47頁,共64頁，2024年2月25日，星期天(二)Westernblot基本原理:

免疫印跡又稱Western印跡(Western

blot)，與DNA的Southern印跡技術相對應，兩種技術均把電泳分離的組分從凝膠轉移至一種固相載體(通常為NC膜)，然后用探針檢測特異性組分。不同的是，Westernblot所檢測的是抗原類蛋白質成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應。該技術結合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復雜混合物中對特定抗原進行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術的靈敏度能達到標準的固相放射免疫分析的水平而無需對靶蛋白進行放射性標記。

第48頁,共64頁，2024年2月25日，星期天Westernblot的過程分四階段a.蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測定b.SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）

c.蛋白質的電轉移(轉膜)d.靶蛋白的免疫學檢測(雜交)1.蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測定A.樣品的制備組織的處理方法：組織洗滌后加入3倍體積預冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOPbuffer，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins離心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。第49頁,共64頁，2024年2月25日，星期天細胞的處理方法：離心收集細胞或者直接往細胞培養(yǎng)瓶內加入5×STOPbuffer，收集，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins離心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。分泌蛋白的提?。褐苯邮占置谝?，加入β-ME、溴酚藍制樣。B.蛋白的定量方法:a.雙縮脲法：b.Lowry法：c.紫外吸收法

:e.Bradford比色法：

第50頁,共64頁，2024年2月25日，星期天2.SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）A：實際操作做膠前的準備1)檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。2)檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。3)按將要檢測的抗體對應的原始抗原的分子量大小，計算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。制膠，電泳1）裝好架子。2)按照<<分子克隆>>配方配制分離膠。在膠上面加入一層蒸餾水，促進膠更好的凝集。3)待分離膠凝集后，配制濃縮膠。

第51頁,共64頁，2024年2月25日，星期天倒好濃縮膠后插入預先準備好的梳子。4)待膠凝集好后，上樣，電泳。上層膠用60-80V電壓，當樣品至分離膠時，用100-120V電壓。一般電泳時間在1.5小時左右。注意事項及常遇到的問題1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。2）上樣蛋白量不應超過樣品槽。3）gel通常在0.5-1h內凝集最好，過快表TEMED、APS用量過多，此時膠太硬易龜裂，而且電泳時容易燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實際不純或失效。第52頁,共64頁，2024年2月25日，星期天4）混合攪拌速度太快產生氣泡影響聚合，導致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。

5）電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：

︶條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。

︵條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。拖尾：樣品溶解不好。紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。條帶兩邊擴散：加樣量過多。第53頁,共64頁，2024年2月25日，星期天3.蛋白質的電轉移(轉膜):

在電流的作用下，使蛋白質從膠轉移至固相載體（膜）上。膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學兼容性。

第54頁,共64頁，2024年2月25日，星期天轉膜有2種方法:A.半干法即將凝膠夾層組合放在吸有轉印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導電流，起到轉移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉移條件比較嚴酷，但是其轉移時間短，效率高。1)實驗條件的選擇電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉移時間，具體可以根據實際適當調整。第55頁,共64頁，2024年2月25日，星期天目的蛋白分子大小(kDa)膠濃度轉移時間(h)801408%1.5-2.02580101.515—40120.75<20150.52)實驗操作（1）濾紙和膜的準備(在電泳結束前20分鐘應開始準備工作)。a.檢查是否有足夠的transferbuffer，沒有立即配制b.檢查是否有合適大小的濾紙和膜。第56頁,共64頁，2024年2月25日，星期天c.將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉入transferbuffer中。d.將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transferbuffer中。（2）轉移a.在電轉移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。b.將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transferbuffer到膜上，保持膜的濕潤。c.將膠剝出，去掉stackgel，小心的移到膜上。d.剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標記出膠的位置。e.將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。倒上些transferbuffer，再鋪兩張靠膠濾紙。f.裝好電轉移儀，根據需要選定所需的電流和時間。g.轉移過程中要隨時觀察電壓的變化，如有異常應及時調整。第57頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第58頁,共64頁，2024年2月25日，星期天3注意事項及常遇到的