藥物研發(fā)和毒性的篩選

藥物研發(fā)和毒性的篩選藥物的基本要求安全、有效、質(zhì)量可控有效安全質(zhì)量可控Benefit/Risk藥理學(xué)毒理學(xué)第2頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天毒理學(xué)的研究領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)和識(shí)別外源性毒物的“潛在危害”的“證據(jù)”探討作用原理，為解毒和安全使用提供“理論基礎(chǔ)”系統(tǒng)的毒性研究，明確安全性范圍。評(píng)價(jià)危險(xiǎn)度評(píng)估和管理法規(guī)及措施的制訂。描述性毒理學(xué)毒理機(jī)制應(yīng)用毒理學(xué)管理和控制第3頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天21世紀(jì)毒性試驗(yàn)的發(fā)展毒性通路針對(duì)性試驗(yàn)毒性試驗(yàn)外源毒物的識(shí)別劑量反應(yīng)建模與外推建模風(fēng)險(xiǎn)背景人群數(shù)據(jù)和暴露數(shù)據(jù)第4頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天毒性通路21世紀(jì)毒性實(shí)驗(yàn)分類針對(duì)性試驗(yàn)

評(píng)價(jià)毒性通路的紊亂，而非頂端終點(diǎn)；強(qiáng)調(diào)采用細(xì)胞或細(xì)胞系，尤其是人源細(xì)胞的高通量試驗(yàn)方法；采用中通量實(shí)驗(yàn)法評(píng)價(jià)細(xì)胞的整體反應(yīng)

開展相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)代謝物、評(píng)估靶組織或者在基因組水平上進(jìn)一步了解受到影響的細(xì)胞過程；限制體內(nèi)研究的種類和期限，重點(diǎn)關(guān)注暴露時(shí)間不超出14天的研究；依據(jù)最新的化學(xué)品分類法，對(duì)代表性的受試物作更為詳盡的測(cè)試第5頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天

內(nèi)源性激素(Endogenoushormones)DNA損傷(DNAdamage)抗氧化劑反應(yīng)（AntioxidantResponsePathway）PXR、CAR、PPAR和AhR受體(PXR,CAR,PPARandAhRreceptors)低滲(Hypo-osmolarity)Nrf2氧化應(yīng)激(Nrf2oxidativestress)熱休克蛋白(Heat-shockproteins)P38MAPK(P38MAPK)。。。。。。已知的主要的毒性通路第6頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天

新藥研發(fā)的技術(shù)模式和研究路徑的轉(zhuǎn)變StrategyandImplementationPlanforAdvancingRegulatoryScienceforMedicinalProducts。2013，USFDA8個(gè)領(lǐng)域中的第一個(gè)：毒理學(xué)的現(xiàn)代化，促進(jìn)革新基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的傳統(tǒng)安全性評(píng)價(jià)方法，具體包括：開展安全性評(píng)價(jià)新方法研究：特別是基于生物標(biāo)記物的評(píng)價(jià)技術(shù)。例如，將細(xì)胞、基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床研究整合。體外實(shí)驗(yàn)以及計(jì)算機(jī)輔助建模方法的研究細(xì)胞株、遺傳工程改造的生物組織模型等方法的開發(fā)第7頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天發(fā)現(xiàn)毒理學(xué)研究

藥物研究早期發(fā)現(xiàn)階段，通過毒理學(xué)篩選和評(píng)價(jià)，及早地發(fā)現(xiàn)和淘汰有嚴(yán)重毒性問題、不適合開發(fā)的化合物，指導(dǎo)合成更安全有效的化合物。 第8頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天意義藥理和毒理學(xué)家同時(shí)采用快速、低耗、高通量篩選系統(tǒng)對(duì)一系列新化學(xué)物進(jìn)行藥效和毒性的同步篩選，找出候選化合物。確定NCEs的毒性作用機(jī)制和定量構(gòu)效關(guān)系,指導(dǎo)化學(xué)家合成毒性較低的系列化合物。毒理學(xué)家基于該類化合物的毒性機(jī)制選出合適的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)行體內(nèi)毒性評(píng)價(jià)。減少動(dòng)物，提高成功率降低費(fèi)用，縮短周期第9頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)涵蓋的毒理學(xué)終點(diǎn)廣試驗(yàn)方法敏感性高使用的樣品量少試驗(yàn)周期短試驗(yàn)技術(shù)方法易于掌握，試劑及儀器費(fèi)用低有效降低新藥研發(fā)的費(fèi)用，加快研發(fā)進(jìn)程不受GLP約束第10頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天主要技術(shù)手段藥物毒性的早期優(yōu)化篩選系統(tǒng)（PreclinicalLeadOptimizationTechnologies,PLOTs)計(jì)算機(jī)模型或?qū)＜蚁到y(tǒng)預(yù)測(cè)新化學(xué)實(shí)體的潛在毒性QSAR，insilicotoxicology

“基因修飾”動(dòng)物模型評(píng)價(jià)候選新藥的毒性、致癌性及其毒作用機(jī)制毒理組學(xué)(-omics)技術(shù)研究藥物的毒性機(jī)制第11頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、藥物毒性的早期優(yōu)化篩選系統(tǒng)（PreclinicalLeadOptimizationTechnologies,PLOTs)第12頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天1)、一般毒性體外試驗(yàn)MTT法：線粒體脫氫酶活性XTT法：線粒體脫氫酶活性CCK-8法：線粒體脫氫酶活性

LDH法：細(xì)胞膜的完整性中性紅法：將染料攝入溶酶體的胞吞作用刃天青法：細(xì)胞的代謝活性苔盼蘭排斥試驗(yàn)：細(xì)胞膜的完整性體內(nèi)試驗(yàn)上下法第13頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天肝細(xì)胞毒性試驗(yàn)離體肝灌流：評(píng)價(jià)藥物毒物在肝臟的代謝動(dòng)力學(xué)，代謝產(chǎn)物情況，對(duì)肝臟的毒性作用以及對(duì)肝臟代謝酶的影響等精密切割的肝切片肝細(xì)胞培養(yǎng)：人肝細(xì)胞、大鼠原代肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞系離體的亞細(xì)胞成分胚胎干細(xì)胞（ES）定向分化成的肝細(xì)胞樣細(xì)胞模型：利用人胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞，一方面通過比較蛋白含量測(cè)定（KB分析），細(xì)胞活性測(cè)定（MTT分析）觀察藥物對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響；另一方面，選擇受試藥物刺激肝細(xì)胞，檢測(cè)肝功能相關(guān)酶ALT、AST、ALP、LDH等；其三，檢測(cè)細(xì)胞色素p450酶活性，觀察藥物對(duì)其影響。第14頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天ADME/T模型及藥物相互作用模型(CYP450s、Pgp、Caco-2、Cocktail)應(yīng)用Caco－2細(xì)胞模型評(píng)價(jià)藥物和毒物的吸收情況、重復(fù)用藥對(duì)藥物吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響、藥物對(duì)腸道細(xì)胞的毒作用以及藥物吸收的毒性成份等。應(yīng)用肝微粒體孵育“cocktail”技術(shù)，根據(jù)藥物在肝微粒體中的消除速率以及在各種與藥物代謝密切相關(guān)的P450酶亞型(如CYP1A2、2C9、2C19、2D6、3A4等)特異性抑制劑存在下的消除速率差異研究，判斷何種酶亞型可能參與了該藥的代謝。第15頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天心臟毒性篩選試驗(yàn)hERG(humanether-a-go-gorelatedgene)鉀離子通道模型基于hERG表達(dá)系統(tǒng),通過膜片鉗技術(shù)觀察hERG通道的電生理學(xué)特性,構(gòu)建藥物致QT間期延長(zhǎng)體外評(píng)價(jià)模型,對(duì)hERG電流的影響,為藥物致QT間期延長(zhǎng)的安全性評(píng)價(jià)提供技術(shù)手段。膜片鉗技術(shù)被稱為研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”。心肌毒性：利用人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞，通過比較蛋白含量測(cè)定（KB分析），細(xì)胞活性測(cè)定（MTT分析）觀察藥物對(duì)心肌細(xì)胞增殖的影響；第16頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天腎臟毒性體外：離體灌注的腎臟離體灌注的腎單位、腎組織切片離體的腎小球、LLC-PK1、OK、MDCK、NRK-52E、HK-2細(xì)胞體內(nèi)：早期腎損傷的生物標(biāo)志物：KIM-1、白蛋白、總蛋白、a2-微球蛋白、胱蛋白酶C（CystatinC）、聚集素（Clusterin）、三葉因子-3（TrefoilFactor-3）

第17頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2)、遺傳毒性Ames波動(dòng)試驗(yàn)Green-Screenassay:利用酵母DNA修復(fù)基因RAD54和報(bào)告基因構(gòu)建利用P53報(bào)告基因構(gòu)建體外微核小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)(MouseLymphomaAssay,MLA)彗星試驗(yàn)第18頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3)、生殖毒性全胚胎培養(yǎng)

(WEC)中腦細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)(MM)胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(EST)第19頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天4)、局部毒性皮膚刺激：TER,EPISKINa,

EPIDERMa、ORROSITEXa光毒性:3T3NRU-PT眼刺激：經(jīng)體外兔去核眼刺激試驗(yàn)(Ex-RET)、眼人組織等價(jià)試驗(yàn)(EpiOcular?)、牛經(jīng)體外角膜混濁透過試驗(yàn)(BCOP)、雞經(jīng)體外去核眼刺激試驗(yàn)(CEET)皮膚過敏：局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)、肽反應(yīng)性試驗(yàn)Alternativetoxicityassay第20頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)試終點(diǎn)體外高通量篩選中通量金標(biāo)準(zhǔn)CYP抑制CYP＋熒光標(biāo)記，IC50HLM＋LC－MSCYP誘導(dǎo)PXR,CAR肝切片，人原代細(xì)胞hERGDofetilide結(jié)合膜片鉗肝毒性肝細(xì)胞、切片培養(yǎng)組織病理學(xué)腎毒性腎細(xì)胞、切片培養(yǎng)組織病理學(xué)遺傳毒性微型Ames，體外微核Amestest安全性藥理放射性配體結(jié)合，功能檢定_高通量毒性篩選(HTS)第21頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天高內(nèi)涵毒性篩選檢測(cè)被篩樣品對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)傳導(dǎo)的影響，在實(shí)驗(yàn)中獲取大量相關(guān)信息。篩選模型：人類及嚙齒動(dòng)物相應(yīng)靶器官（肝、腎、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)）的體外培養(yǎng)細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)：細(xì)胞丟失、DNA降解、核大小、細(xì)胞骨架紊亂、DNA損傷反應(yīng)、氧化應(yīng)激、有絲分裂指標(biāo)、應(yīng)激激酶激活、線粒體功能、細(xì)胞周期阻滯第22頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天成像技術(shù)的應(yīng)用fPETfMRIOIIRPETMRIMRSIPETUSGMRSISPECT

PETIRX-rayMRICTUSG機(jī)能分子代謝生理學(xué)解剖學(xué)MRI=磁共振成像;CT=電腦斷層掃描;USG=超聲波掃描術(shù)y;MRSI=磁共振波譜成像;PET=正電子成像術(shù);SPECT=單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描;IR=紅外;fPET=功能性正電子成像術(shù);fMRI=功能性磁共振成像;OI=光學(xué)成像非侵襲/動(dòng)物數(shù)量減少同一動(dòng)物的發(fā)育

衰老動(dòng)物用作自身對(duì)照同一動(dòng)物的每天多項(xiàng)研究平行進(jìn)行解剖和機(jī)能評(píng)價(jià)第23頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、計(jì)算機(jī)模型或?qū)＜蚁到y(tǒng)預(yù)測(cè)新化學(xué)實(shí)體的潛在毒性

QSAR，insilicotoxicology

第24頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天藥物早期虛擬篩選程序用計(jì)算機(jī)篩選的方法稱為虛擬篩選，或稱insilico篩選，成為insilico-invitro-invivo模式。用一系列“基于知識(shí)的濾網(wǎng)”對(duì)虛擬庫(kù)“篩選”，以“濃縮”出能夠滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)的化合物。這些濾網(wǎng)包括類藥性(druglike)，藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，毒性，知識(shí)產(chǎn)權(quán)問題以及與受體的互補(bǔ)性或與配體的相似性等，是通過數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋和計(jì)算化學(xué)實(shí)現(xiàn)的。第25頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天計(jì)算機(jī)輔助藥物毒性篩選模型P450酶抑制劑與P450s的相互作用模型分子對(duì)接和動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合自由能預(yù)測(cè)化合物的構(gòu)效關(guān)系模型化合物的結(jié)構(gòu)和活性（毒性）計(jì)算機(jī)輔助藥物毒性篩選模型第26頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天計(jì)算機(jī)模型或?qū)＜蚁到y(tǒng)Commerciallyavailabletoxicityestimationpackagesareavailabletopredictavarietyoftoxicendpointsincludingmutagenicity,carcinogenicity,teratogenicity,skinandeyeirritationandacutetoxicity:DEREK(DeductiveEstimationofRiskfromExistingKnowledge)-www.chem.leeds.ac.uk/lukHazardExpert–/hazardCASE(ComputerAutomatedStructureEvaluation)– TOPKAT(ToxicityPredictionbyComputerAssisted

Technology)–/products/topkatOncoLogic–DILIsim-druginducedliverinjury(DILI)第27頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天ToxEffectsinDrugDesignToxEffectAcute(LD50)Organ-specificeffectsMutagenicityReproductiveeffectsCarcinogenicityProgramsTopkat,AB/LD50AB/Tox*(nextversion)Manyprograms,AB/ToxManyprograms,AB/Tox*Manyprograms,AB/Tox*第28頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、“基因修飾”動(dòng)物技術(shù)（轉(zhuǎn)基因、基因敲除、人源化基因敲入動(dòng)物）的應(yīng)用

第29頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)基因和基因敲除動(dòng)物模型：肝毒性Hsp70i基因敲除小鼠模型金屬硫蛋白（MT）-I/II敲除小鼠γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶缺乏小鼠Nrf2基因敲除小鼠Sod2+/-雜合子K