熒光原位雜交

原位雜交（ISH）原位雜交(insituhybridization,ISH)

將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交。原位雜交技術(shù)(ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補(bǔ)的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置。第2頁,共40頁，2024年2月25日，星期天基本原理根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA兩條單鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA或與mRNA互補(bǔ)的cDNA作探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測核酸(RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DAN的存在與定位。第3頁,共40頁，2024年2月25日，星期天3H、35S、125I、32P等原位雜交常用標(biāo)記物質(zhì)70年代80年代中后期放射性同位素12熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)2第4頁,共40頁，2024年2月25日，星期天同位素原位雜交的不足之處：1、不穩(wěn)定2、高背景3、曝光時間長4、結(jié)果統(tǒng)計處理繁瑣5、同位素的使用和處理

第5頁,共40頁，2024年2月25日，星期天幾種原位雜交技術(shù)1基因組原位雜交技術(shù)2熒光原位雜交技術(shù)3多彩色熒光原位雜交技術(shù)4原位PCR第6頁,共40頁，2024年2月25日，星期天熒光原位雜交熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子(reportermolecule)結(jié)合,雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料。第7頁,共40頁，2024年2月25日，星期天FISH的基本原理FISH基本原理是利用同源互補(bǔ)的待檢染色體與用生物素、地高辛標(biāo)記過的核酸探針,經(jīng)變性-退火-復(fù)性,形成待檢DNA與核酸探針的雜交體。使探針與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間發(fā)生免疫化學(xué)反應(yīng),最后用熒光顯微鏡對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。第8頁,共40頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共40頁，2024年2月25日，星期天發(fā)展歷史1974年Evans首次將染色體顯帶技術(shù)和染色體原位雜交聯(lián)合應(yīng)用，提高了定位的準(zhǔn)確性。20世紀(jì)70年代后期人們開始探討熒光標(biāo)記的原位雜交，即FISH技術(shù)。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標(biāo)本上，標(biāo)志著染色體定位技術(shù)取得了重要進(jìn)展。第10頁,共40頁，2024年2月25日，星期天1969年Gall和Pardue以及Pardue等人利用放射性同位素標(biāo)記的核酸探針對DNA進(jìn)行了雜交,開創(chuàng)了RNA-DNA的同位素原位雜交技術(shù)。他們都是采用放射性同位素標(biāo)記探針,需要采用放射自顯影進(jìn)行檢測,這種檢測上的限制及當(dāng)時分子克隆方法的缺乏使得DNA原位雜交技術(shù)不能很快得到廣泛應(yīng)用。第11頁,共40頁，2024年2月25日，星期天1974年，Evans第一次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來,提高了基因定位的準(zhǔn)確性。1975年,Manning等最先在溶液的分子雜交中,使用非放射性標(biāo)記,通過細(xì)胞色素C將生物素與RNA分子連接起來。1977年Rudkin發(fā)明了用間接免疫熒光法檢測目的DNA的非同位素原位雜交(NISH)。第12頁,共40頁，2024年2月25日，星期天1981年，Langer等首次采用生物素標(biāo)記的核苷酸探針成功地進(jìn)行了染色體原位雜交,建立了非放射性原位雜交技術(shù)。至此,以熒光標(biāo)記的探針在細(xì)胞制片上進(jìn)行基因原位雜交的技術(shù)建立起來。1985年，原位雜交技術(shù)被引進(jìn)到植物。1986年，Cremer與Licher等分別證實了熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用于間期核檢測染色體非整倍體的可行性,從而開辟了間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究。第13頁,共40頁，2024年2月25日，星期天20世紀(jì)90年代，隨著人類基因組計劃的進(jìn)行，由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。第14頁,共40頁，2024年2月25日，星期天FISH樣本的制備探針的制備探針標(biāo)記雜交（染色體顯帶）熒光顯微鏡檢測結(jié)果分析實驗流程第15頁,共40頁，2024年2月25日，星期天DNARNAPNA將探針置于載玻片上制片F(xiàn)ISH基本實驗過程雜交加蓋玻片變性檢測在熒光顯微鏡下觀察第16頁,共40頁，2024年2月25日，星期天探針的制備探針（probe)是指用于檢測特定基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在或表達(dá)的DNA、RNA或寡核苷酸序列。雜交實驗所選擇的核酸探針可以分為三種：化學(xué)合成、克隆和PCR。第17頁,共40頁，2024年2月25日，星期天探針的分類根據(jù)化學(xué)組成，可以將探針分為DNA、RNA、PNA及寡核苷酸探針。DNA探針這類探針應(yīng)用最廣，可以通過化學(xué)合成、克隆或PCR技術(shù)獲得。RNA探針一般用RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄克隆的DNA序列獲得。RNA-RNA雜交分子在所有可能的雜交分子中最穩(wěn)定，但RNA探針容易被RNase降解。第18頁,共40頁，2024年2月25日，星期天肽核苷酸（PNA）探針

PNA寡聚物是一類新分子，其結(jié)構(gòu)與DNA相似。但在PNA中，沒有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不帶電的肽鏈(聚酰胺）。第19頁,共40頁，2024年2月25日，星期天PNA與DNA雜交時也

遵循堿基互補(bǔ)配對原則第20頁,共40頁，2024年2月25日，星期天與DNA相比，PNA對熱穩(wěn)定、與DNA的結(jié)合不依賴于離子強(qiáng)度，因此雜交時，受探針變性溫度和溶液PH的影響較小，鑒于這些特點和優(yōu)點，PNA有望取代DNA或RNA作為FISH的探針。但由于PNA探針只能通過化學(xué)方法進(jìn)行合成，而且合成費用高，因此迄今所用的PNA探針還僅限于染色體的泛著絲粒和泛端粒探針。第21頁,共40頁，2024年2月25日，星期天寡核苷酸探針?biāo)歉鶕?jù)探針靶序列的堿基順序用化學(xué)方法合成的單鏈DNA，其長度為15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易滲透到細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域；但也正由于分子小，限制了其所能攜帶的熒光基團(tuán)或報告分子數(shù)目，并最終導(dǎo)致雜交后熒光信號較弱。因此這類探針僅實用于對重復(fù)單位較短的高度重復(fù)序列的熒光原位雜交分析。第22頁,共40頁，2024年2月25日，星期天探針標(biāo)記為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號。熒光原位雜交得探針常用熒光素或地高辛進(jìn)行標(biāo)記。探針標(biāo)記可以采用均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記的方法。第23頁,共40頁，2024年2月25日，星期天對探針進(jìn)行標(biāo)記時，可復(fù)制合成一段新探針分子，在復(fù)制合成過程滲入標(biāo)記核苷酸，從而使整個新分子被均勻地標(biāo)記。其顯著的特點是標(biāo)記不局限一個位點，而是均勻地滲入，探針的信號強(qiáng)。均勻標(biāo)記有切口平移法、隨機(jī)引物法和PCR擴(kuò)增等方法。均勻標(biāo)記第24頁,共40頁，2024年2月25日，星期天切口平移標(biāo)記法標(biāo)記部分第25頁,共40頁，2024年2月25日，星期天切口平移法可對環(huán)狀或線性雙鏈DNA進(jìn)行標(biāo)記。一般對克隆的DNA片段用這種方法標(biāo)記的效果較好。該方法使用時應(yīng)注意：A.只能標(biāo)記雙鏈DNA使用探針時要預(yù)先變性后再使用，而且標(biāo)記時DNA片段不太小B.DNA酶I使用的量要合適太多會將DNA模板切碎，不能進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)；太少則不能有效地打開缺口，使標(biāo)記物不能進(jìn)入缺口C.標(biāo)記時間不能太短太短時間會造成標(biāo)記量不足，影響雜交的進(jìn)行

第26頁,共40頁，2024年2月25日，星期天隨機(jī)引物標(biāo)記法第27頁,共40頁，2024年2月25日，星期天1、不但可用于雙連DNA的標(biāo)記，而且可用于單連DNA和RNA的標(biāo)記2、操作簡單3、標(biāo)記率高隨機(jī)引物法的特點第28頁,共40頁，2024年2月25日，星期天PCR標(biāo)記法第29頁,共40頁，2024年2月25日，星期天末端標(biāo)記直接將探針分子的某個原子替換為放射性同位素原子，或直接在探針分子上加上標(biāo)記的原子或復(fù)合物，這種直接標(biāo)記一般是在探針分子的末端進(jìn)行，所以稱之為末端標(biāo)記。經(jīng)過末端標(biāo)記的核酸分子除作為雜交探針外，更多的用于RNAS1作圖以及引物延伸反應(yīng)中的標(biāo)記引物。第30頁,共40頁，2024年2月25日，星期天末端標(biāo)記法第31頁,共40頁，2024年2月25日，星期天染色體顯帶顯帶染色是將染色體經(jīng)過一定程序的處理,并用特定的染料染色后,使染色體在其長軸上顯示出一個個明暗交替或深淺不同的橫紋,這樣的橫紋就叫做染色體的帶。食管癌細(xì)胞系24色染色體mFISH核型分析第32頁,共40頁，2024年2月25日，星期天每條染色體都含有一定數(shù)量、一定排列順序、一定寬窄和染色深淺或明暗不同的帶,這就構(gòu)成了每條染色體的帶型。顯示染色體帶的過程稱為染色體顯帶。染色體顯帶為染色體的研究提供了一個十分有效的方法。染色體的顯帶技術(shù)分為兩大類:一類為整條染色體的顯帶技術(shù)；另一類為染色體局部的顯帶技術(shù)。第33頁,共40頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共40頁，2024年2月25日，星期天奧芬蘭海水硝化細(xì)菌熒光原位雜交全菌（采用EUBMIX型探針）氨氧化細(xì)菌（采用NSO1225型探針）全菌（采用EUBMIX型探針）亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（采用NIT3型探針）第35頁,共40頁，2024年2月25日，星期天熒光原位雜交特點

優(yōu)點1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；3、實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；第36頁,共40頁，2024年2月25日，星期天5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。第37頁,共40頁，2024年2月25日，星期天

缺點1、不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時效率明顯下降。2、必須在已知探針的情況下方可進(jìn)行。第38頁,共40