2.9 蛋白質(zhì)樣品的前期處理

主講老師：邢煜騫蛋白質(zhì)樣品的前期處理蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化是當(dāng)代生物產(chǎn)業(yè)中的核心技術(shù)，是基因工程制藥產(chǎn)業(yè)中的重要環(huán)節(jié)。捕獲粗純精純蛋白樣品的前期處理預(yù)處理

離心過濾細(xì)胞破碎機(jī)械破碎非機(jī)械破碎固液分離離心過濾水相萃取常用細(xì)胞破碎方法分類作用機(jī)理適應(yīng)性機(jī)械法珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌超聲破碎法液體剪切作用對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合非機(jī)械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活高壓勻漿法利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液通過針型閥后，因高速撞擊和突然減壓而使細(xì)胞破裂的方法?？梢源笠?guī)模應(yīng)用，不適用于易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌、較小的革蘭氏陽性菌、以及含有包含體的基因工程菌。高速珠磨法將細(xì)胞懸浮液與研磨劑(通常是直徑＜1mm的無鉛玻璃小珠)一起快速攪拌或研磨，利用玻璃珠間以及玻璃珠與細(xì)胞間的相互剪切、碰撞促進(jìn)細(xì)胞壁破裂而釋放出內(nèi)含物。產(chǎn)生大量的熱，必須采取冷卻措施。超聲破碎法利用超聲波來處理細(xì)胞懸浮液，在超聲波作用下，液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。可處理少量樣品，產(chǎn)生熱量大，敏感物質(zhì)易失活。高壓擠壓法把濃縮的細(xì)胞懸液冷凍成冰晶，用高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥孔中擠出，由于冰晶體磨損和包埋在冰中的細(xì)胞變形引起細(xì)胞破碎。破碎率高，細(xì)胞碎片粉碎程度低，生物活性保持較好。不適用對凍融敏感的生物活性物質(zhì)。機(jī)械破碎法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)速度快，處理量較大，不帶入其它化學(xué)物質(zhì)缺點(diǎn)產(chǎn)生熱量，要采取冷卻措施，防止目的產(chǎn)物失活滲透沖擊法將細(xì)胞置于高滲介質(zhì)中，平衡后，突然稀釋介質(zhì)或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞壁的破裂。溫和，操作簡單，僅適用于細(xì)胞壁較脆弱、經(jīng)酶預(yù)處理的菌，或細(xì)胞壁合成受抑制而強(qiáng)度減弱的菌。增溶法利用表面活性劑等化學(xué)試劑的增溶作用，增加細(xì)胞壁和膜的通透性使細(xì)胞破碎的方法。表面活性劑：SDS,TritonX-100有機(jī)溶劑：乙醇、異丙醇、尿素、鹽酸胍金屬螯合劑：EDTA（G－菌）缺點(diǎn)：添加新的化學(xué)試劑，造成新的污染脂溶法有機(jī)溶劑與細(xì)胞壁和膜上的脂質(zhì)作用，導(dǎo)致細(xì)胞壁膨脹、破裂，釋放出胞內(nèi)物質(zhì)。如：甲苯、氯苯、異丙苯、二甲苯等。酶溶法利用生物酶消化溶解細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的方法。如溶菌酶、葡聚糖酶、糖苷酶等優(yōu)點(diǎn)產(chǎn)物可選擇性釋放、核酸泄出量少、細(xì)胞外形完整缺點(diǎn)溶酶價(jià)格高，回收利用難，大規(guī)模使用成本高；通用性差，最佳條件不易確定；存在產(chǎn)物抑制作用，釋放率低；只限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。非機(jī)械破碎法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)選擇性高，胞內(nèi)產(chǎn)物的總釋放率低，特別是可有效抑制核酸的釋放，料液黏度小，利于后處理過程缺點(diǎn)