呼吸道病原體檢測

呼吸道病原體檢測

2021/3/29星期一1呼吸道感染呼吸道感染是指病原體感染人體的鼻腔、咽喉、氣管和支氣管等呼吸系統(tǒng)分為上呼吸道感染和下呼吸道感染2021/3/29星期一2上呼吸道感染常見急性上呼吸道感染，指鼻腔、咽或喉部急性炎癥的概稱，是呼吸道最常見的一種傳染病常見病因為病毒，少數(shù)由細(xì)菌引起。患者不分年齡、性別、職業(yè)和地區(qū)。不僅具有較強的傳染性，而且可引起嚴(yán)重并發(fā)癥2021/3/29星期一3下呼吸道感染包括急性氣管/支氣管炎、慢性支氣管炎、肺炎、支氣管擴張等由病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體、軍團菌等微生物引起，其防治應(yīng)遵循預(yù)防為主、準(zhǔn)確診斷、及時治療的原則，治療時必須明確引起感染的病原體以選擇有效的抗生素2021/3/29星期一4呼吸道病原體常見的呼吸道病原體主要有病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體和立克次體等據(jù)統(tǒng)計，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起一種病原體可引起多種臨床癥狀，同一臨床表現(xiàn)可由多種病原體引起2021/3/29星期一5呼吸道病原體細(xì)菌：細(xì)菌引起呼吸道感染的機會比病毒少。一旦感染，癥狀多較嚴(yán)重，定位比較明顯，如扁桃體炎、中耳炎、鼻竇炎等。由細(xì)菌引起的兒童肺炎往往是流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌或金黃色葡萄球菌2021/3/29星期一6呼吸道病原體病毒，包括鼻病毒、冠病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等2021/3/29星期一7呼吸道病原體支原體、衣原體感染導(dǎo)致的呼吸道感染與其它病原體感染的早期臨床表現(xiàn)類似。可能在2-3天后咳嗽的癥狀會表現(xiàn)比較突出。在小于30歲的年輕人中，肺炎支原體是最重要的下呼吸道病原體2021/3/29星期一8非典型呼吸道病原體是指除肺炎鏈球菌以外的病原體，包括嗜肺軍團菌(LP)、肺炎支原體(MP)、肺炎衣原體(CP)、Q熱立克次體(貝納柯克斯體)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(IFV)和副流感病毒(PIV)等2021/3/29星期一9非典型呼吸道病原體這些病原體變異快，傳播廣，由于不易形成長期免疫力而難以預(yù)防和控制流感病毒副流感病毒病毒呼吸道合胞病毒腺病毒2021/3/29星期一10呼吸道病原體檢測現(xiàn)有的主要方法：病毒分離培養(yǎng)抗原檢測抗體檢測分子生物學(xué)方法等2021/3/29星期一11檢測方法的比較檢測方法優(yōu)點缺點病毒分離培養(yǎng)特異性高，金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件要求高、靈敏度低，標(biāo)本中病原體量少時，易致假陰性。抗原檢測直接免疫熒光法簡便、快速、靈敏度和特異性均較高且可用于疾病的早期診斷需要特異性抗體、熒光顯微鏡，易受采樣限制抗體檢測間接免疫熒光法靈敏度、特異性較高對疾病早期診斷沒有太大幫助酶聯(lián)免疫吸附法較快速，批量篩查特異性不高，假陽性多分子生物學(xué)方法靈敏度和特異性均很高操作繁瑣，價格昂貴2021/3/29星期一12抗體、抗原檢測的比較抗體IgM檢測病原體抗原檢測檢測最佳時間一般在感染一周左右病毒感染出現(xiàn)癥狀后即可檢測出臨床意義回顧性診斷，適用于疾病中后期的診斷，可用于疾病早期診斷，對患者的治療有重要指導(dǎo)意義檢測靈敏度將包被有不同基質(zhì)的生物薄片固定在一個反應(yīng)區(qū)中，可同時檢測多種抗不同病原體的抗體檢測方法一般使用ELISA或者間接免疫熒光法，有非特異性熒光一般使用直接免疫熒光法，幾乎沒有非特異性反應(yīng)，敏感性較差2021/3/29星期一13IgMIgG2021/3/29星期一14機體產(chǎn)生IgM一般需要一周左右的時間，而有免疫缺陷或免疫系統(tǒng)不健全的個體如兒童，特別是3歲以下的小孩，其產(chǎn)生抗體往往需要更久，且抗體產(chǎn)生的水平也較低若檢測的是IgG，則不能很好地區(qū)分既往感染和急性感染2021/3/29星期一15因此，抗原檢測的方法對嬰幼兒和兒童的呼吸道感染的病因診斷、鑒別診斷和臨床用藥指導(dǎo)比抗體法更有優(yōu)勢檢測抗體IgM比IgG更有臨床意義2021/3/29星期一16采樣抗原檢測拭子伸入鼻部后向鼻咽部水平伸入，不是向鼻腔伸入。

伸入距離為從耳垂部到鼻尖長度的一半，一般針對兩周歲以下兒童，伸入距離約為拭子絨毛頭的長度兩倍拭子伸入后要輕輕捻動拭子轉(zhuǎn)3圈。

取樣后在一小時之內(nèi)洗脫到生理鹽水中，12小時內(nèi)送檢2021/3/29星期一17抗原檢測采樣2021/3/29星期一18采樣抗體檢測2021/3/29星期一19采樣對結(jié)果影響較大非典型感染多為干咳，無痰/少痰陽性率低（標(biāo)本問題，病毒顆粒?。┛乖隗w內(nèi)存在時間短抗原檢測的劣勢2021/3/29星期一20九項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測2021/3/29星期一21檢測原理間接免疫熒光法（IFA）是基于待測樣本中的抗體與吸附在載玻片上的抗原發(fā)生的反應(yīng)。樣本中存在的特異性抗體和抗原反應(yīng)，未與抗原結(jié)合的免疫球蛋白在洗滌步驟中除去。在下一步驟中，抗原-抗體復(fù)合物與熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白反應(yīng)，用免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果2021/3/29星期一22試劑盒組成組分成分和用途載玻片檢測的物理載體，覆有聚四氟乙烯并包被有針對檢測物的特異性抗原，質(zhì)控品吸附劑羊抗人IgG用來吸附人IgG避免干擾IgM檢測FITC結(jié)合物熒光素標(biāo)記的抗人免疫球蛋白結(jié)合物，和抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)，并顯色封閉介質(zhì)甘油緩沖液，便于觀察磷酸鹽緩沖液(PBS)用于洗滌步驟，從反應(yīng)介質(zhì)中除去未結(jié)合的免疫球蛋白和結(jié)合物2021/3/29星期一23實驗步驟1樣本的稀釋：血清標(biāo)本與PBS按1:1比例稀釋稀釋后的血清加入吸附劑中，徹底混勻。處理后的血清要離心10-15分鐘除去沉淀，以防干擾檢測2021/3/29星期一24實驗步驟22021/3/29星期一25結(jié)果判斷2021/3/29星期一26陰性結(jié)果熒光圖譜軍團菌、肺炎衣原體和立克次體無熒光；支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色2021/3/29星期一27陽性結(jié)果熒光圖譜腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒對陽性血清的1-15%細(xì)胞的細(xì)胞核、胞漿或胞膜出現(xiàn)蘋果綠色熒光；軍團菌、衣原體或立克次體中所有的細(xì)菌呈現(xiàn)出蘋果綠色熒光；支原體對陽性血清在細(xì)胞外圍呈現(xiàn)蘋果綠色熒光2021/3/29星期一28病原體形態(tài)或熒光模式嗜肺軍團菌桿狀肺炎支原體細(xì)胞外圍熒光模式立克次體球桿狀肺炎衣原體球狀腺病毒混合熒光模式（細(xì)胞核和胞漿或胞膜）呼吸道合胞病毒混合熒光模式（細(xì)胞核和胞漿或胞膜）甲型流感病毒混合熒光模式（細(xì)胞核和胞漿或胞膜）乙型流感病毒混合熒光模式（細(xì)胞核和胞漿或胞膜）副流感病毒混合熒光模式（細(xì)胞核和胞漿或胞膜）2021/3/29星期一29嗜肺軍團菌陰性：熒光弱、少、不規(guī)則2021/3/29星期一30嗜肺軍團菌陽性：熒光密集，且亮度較好，桿狀形態(tài)2021/3/29星期一31肺炎支原體陰性：紅色細(xì)胞周圍無或少量熒光，亮度弱2021/3/29星期一32肺炎支原體陽性：熒光占視野50%以上，亮度好，形態(tài)為明顯的細(xì)胞膜或胞漿2021/3/29星期一33Q熱立克次體陰性：熒光弱、少、不規(guī)則2021/3/29星期一34Q熱立克次體陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，形態(tài)典型2021/3/29星期一35肺炎衣原體陰性：熒光弱、少2021/3/29星期一36肺炎衣原體陽性：熒光密集，且亮度較好2021/3/29星期一37腺病毒陰性：熒光弱、少2021/3/29星期一38腺病毒陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，平均每個視野的陽性細(xì)胞>3-5個2021/3/29星期一39呼吸道合胞病毒陰性：熒光弱、少2021/3/29星期一40呼吸道合胞病毒陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，平均每個視野的陽性細(xì)胞>3-5個2021/3/29星期一41甲型流感病毒陰性：熒光弱、少2021/3/29星期一42甲型流感病毒陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，平均每個視野的陽性細(xì)胞>3-5個2021/3/29星期一43乙型流感病毒陰性：熒光弱、少2021/3/29星期一44乙型流感病毒陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，平均每個視野的陽性細(xì)胞>3-5個2021/3/29星期一45副流感病毒陰性：熒光弱、少2021/3/29星期一46副流感病毒陽性：熒光亮度強且數(shù)量多，平均每個視野的陽性細(xì)胞>3-5個2021/3/29星期一47方法的局限性抗體水平無顯著上升時不能排除感染的可能性單一樣本抗體檢測結(jié)果不能幫助作出近期感染的診斷。應(yīng)采集雙份樣本（急性期和康復(fù)期）同時檢測來觀察血清轉(zhuǎn)化或抗體水平的明顯升高2021/3/29星期一48方法的局限性對患有自身免疫性疾病病人的血清，用IFA檢測時，支原體、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，會在細(xì)胞上發(fā)生非特異性反應(yīng)，這些血清不能用此方法評價質(zhì)控孔用于檢測這種現(xiàn)象2021/3/29星期一49方法的局限性在嗜肺軍團菌和Q熱立克次體中，有時血清會含有與卵抗原反應(yīng)的抗體，所以使用卵黃囊固定抗原會出現(xiàn)非特異性熒光。當(dāng)出現(xiàn)這種情況時，該血清就不能用IFA進行分析了2021/3/