第十一章 DNA的復(fù)制課件

第十一章

DNA的復(fù)制第一節(jié) 半保留復(fù)制的驗(yàn)證半保留模型（semioconservetivemodel）

全保留復(fù)制模型(conservetivemodel)

分散模型(Dispersivemodel)。第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制驗(yàn)證半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)一、Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn)

二、Taylar實(shí)驗(yàn)

三、姐妹染色單體差別染色方法（sister-chromatiddifferentialstaining）

5溴脫氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，簡稱BUdR）斑色染色體（Harlequinchromosome）四、Cairns復(fù)制模型—θ型復(fù)制

第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制

圖11-4Taylor蠶豆根尖放射自顯影實(shí)驗(yàn)。

(a)按半保留復(fù)制預(yù)期DNA在復(fù)制過程中標(biāo)記情況；(b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果染色體放射自顯影的圖示。第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第二節(jié)

復(fù)制的起點(diǎn)、方向和終點(diǎn)

一.研究方法：

1.用同位素標(biāo)記電鏡觀察及變性法2.用噬菌體插入標(biāo)記法同步培養(yǎng)不同步培養(yǎng)

3.變性定性法（denaturationmapping）

4.雙向電泳法第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制圖11-11不同步培養(yǎng)時(shí)各標(biāo)記的拷貝數(shù)不同

復(fù)制起點(diǎn)標(biāo)記的拷貝數(shù)應(yīng)最多第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制二、原核的復(fù)制起點(diǎn)和方向

E.coli定點(diǎn)、雙向?qū)ΨQ復(fù)制。

T7在近一端的17％處開始，向兩端延伸?？莶輻U菌有固定的起始點(diǎn)，雙向不對稱復(fù)制。質(zhì)粒R6K早期為單向復(fù)制，復(fù)制了約1/5基因組進(jìn)行時(shí)雙向復(fù)制。質(zhì)粒ColE1有固定起始點(diǎn)，但卻為單向復(fù)制。

mtDNA進(jìn)行D（displacedloop）環(huán)復(fù)制

真核有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)（i），雙向等速復(fù)制。第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制D環(huán)復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第三節(jié)

DNA復(fù)制突變型的篩選根據(jù)溫度敏感性篩選同位素標(biāo)記法篩選5－溴尿嘧啶摻入法質(zhì)粒溫度敏感性的篩選根據(jù)抗藥性篩選根據(jù)與突變有關(guān)的生物學(xué)功能篩選快停突變與慢停突變第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第四節(jié)

原核生物復(fù)制的酶系統(tǒng)DNA合成酶

DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3'－OH；（3）合成的方向都是5‘→3’（4）除聚合DNA外還有其它功能。第十一章DNA的復(fù)制

表11-1E.coli中的三種DNA多聚酶

DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ結(jié)構(gòu)分子量

109KD90KD900KD構(gòu)成

單體單體異多聚體分子數(shù)/細(xì)胞

400？10-20酶活性：5→3`聚合酶

+++3`→5`外切酶

+++5`→3`外切酶

+－－(可切單鏈)突變體突變位點(diǎn)polApolBpolC(dnaE),dnaN,dnaZX,dnaQ,dnaT突變表型修復(fù)有缺陷能修復(fù)阻止復(fù)制

第十一章DNA的復(fù)制(一).DNA聚合酶I的結(jié)構(gòu)DNA聚合酶有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：(1)模板結(jié)合位點(diǎn)；(2)引物結(jié)合位點(diǎn)；(3)引物3‘－OH結(jié)合位點(diǎn)；(4)底物dNTP結(jié)合位點(diǎn)；(5)5‘→3’外切酶結(jié)合位點(diǎn)；(6)3'→5'校正位點(diǎn)。第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制(二).DNA聚合酶Ⅰ的功能

1.5‘→3’聚合功能

2.3‘→5’外切活性

3.5‘→3’外切活性

(1)切口平移（nicktranslation）；

(2)鏈的置換；

(3)模板轉(zhuǎn)換（template-switching）

4.內(nèi)切酶活性第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制(三)DNA多聚酶Ⅲ的結(jié)構(gòu)第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制全酶在DNA上的裝配分為三個(gè)階段：（1）一個(gè)β二聚體加上一個(gè)γ復(fù)合體識(shí)別引物模板形成一種前起始復(fù)合物。（2）DNA在于β,γ復(fù)合體結(jié)合的位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生改變，而對核心酶產(chǎn)生了高親和。使核心酶能與DNA結(jié)合。（3）τ二聚體結(jié)合核心聚合酶，使其二聚化。第十一章DNA的復(fù)制二.DNA連接酶

其作用機(jī)制是分三步進(jìn)行：1、E＋ATP→E－AMP＋ppi

在E.coli中，

E＋NAD→E－AMP＋NMN（煙酰胺單核苷酸）2、E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5‘-PO4上使其活化3、活化的5‘－PO4與相鄰的3’－OH作用形成3‘－5’

磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。第十一章DNA的復(fù)制三.單鏈結(jié)合蛋白又稱為雙螺旋去穩(wěn)定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177個(gè)aa組成在E.coli中以四聚存在分子量為74KDa在原核中SSB與DNA結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。（1）SSB之間的相互作用；（2）第一個(gè)SSB和DNA的結(jié)合改變了DNA的結(jié)構(gòu)。第十一章DNA的復(fù)制四.解旋酶(helicase)第十一章DNA的復(fù)制第五節(jié)原核生物，噬菌體和病毒的復(fù)制起

始和終止一.環(huán)狀DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制第十一章DNA的復(fù)制復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：（1）富含A－T，這可能和雙鏈易于解開起始復(fù)制有關(guān)；（2）含有多個(gè)回文結(jié)構(gòu)（9－14個(gè)GATC）

8個(gè)GATC較保守,CATC中的“A”已甲基化;（3）具有4個(gè)反向重復(fù)順序，作為蛋白結(jié)合位點(diǎn)；（4）此順序的右側(cè)毗鄰區(qū)域有兩個(gè)起動(dòng)子，其可能的作用是：①轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生引物；②產(chǎn)生復(fù)制必要的蛋白；③產(chǎn)生調(diào)節(jié)功能的RN