實驗六誘導(dǎo)細胞融合-聚乙二醇法

實驗六

誘導(dǎo)細胞融合——聚乙二醇法細胞生物學(xué)實驗細胞融合可在自然條件下或利用人工條件(生物的、物理的、化學(xué)的)下進行聚乙二醇分子能改變各類細胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發(fā)生融合,形成雙核或多核細胞

通過有絲分裂，細胞核便發(fā)生融合，形成雜種細胞。細胞融合是指兩個或兩個以上的細胞合并成為一個具有雙核或多核細胞的過程。在自然情況下，體內(nèi)和體外培養(yǎng)的細胞均能發(fā)生自發(fā)融合現(xiàn)象。細胞融合已成為研究細胞遺傳、細胞免疫，腫瘤及細胞工程的重要手段了解細胞融合的原理掌握用PEG誘導(dǎo)細胞融合的方法

材料：雞,兔混合全血

試劑50%聚乙二醇(PEG,MW=4000)

GKN液Hanks溶液生理鹽水0.2%次甲基藍溶液抗凝劑:肝素溶液(250μg/ml)或Alsver液器材：顯微鏡，離心機，水浴鍋，電爐，量筒，離心管，注射器，試管，移液管，燒杯，吸管，載玻片，蓋玻片等。雞血準備：用注射器吸入1mLAlsver液后從雞翼下靜脈取雞血2mL，注入刻度離心管內(nèi)，按照3：1(V／V)加入6mLAlsver液混勻，放入4℃冰箱內(nèi)可保存3--4天。兔血準備混合血液取抗凝全血1mL，移入10mL離心管，

加入4mL0.85％生理鹽水混勻,洗滌,1500r/min離心5min。重復(fù)洗滌2次收集最后1次離心沉淀的血細胞，加入適量的GKN液或Ringer溶液，按壓積紅細胞體積配成5％的紅細胞懸液。取懸液1mL到試管中，加入37℃預(yù)熱的50％PEG0.8mL邊加邊搖動,在1min內(nèi)加完,充分混勻,靜置90秒.以室溫為對照加入GKN或Ringer或Hanks液5ml終止PEG的作用(在30℃下完成)鏡檢鏡檢取1滴PEG誘導(dǎo)后血細胞懸液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片,觀察細胞融合狀況.取1滴PEG誘導(dǎo)后血細胞懸液滴于載玻片上,再加入0.2%次甲基藍溶液1滴,蓋上蓋玻片,觀察細胞融合狀況計算融合率(%)融合率=融合細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%觀察時注意不同程度的融合現(xiàn)象。通常分為五個階段。①兩細胞膜接觸，粘連；②細胞膜形成穿孔；③兩細胞的細胞質(zhì)連通；④通道擴大，兩細胞連成一體；⑤細胞完全合并，形成一個含有兩個或多個核的圓形細胞。

PEG誘導(dǎo),0.2%次甲基藍染色,雞血細胞融合情況以肝素抗凝血取代原方法中Alsver液鏡檢時以凹玻片取代普通載玻片準確區(qū)分細胞融合還是細胞重疊進行染色處理提高分辨力利用光學(xué)顯微鏡或倒置顯微鏡(高倍)