實(shí)驗(yàn)六誘導(dǎo)細(xì)胞融合-聚乙二醇法

實(shí)驗(yàn)六

誘導(dǎo)細(xì)胞融合——聚乙二醇法細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合可在自然條件下或利用人工條件(生物的、物理的、化學(xué)的)下進(jìn)行聚乙二醇分子能改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合,形成雙核或多核細(xì)胞

通過有絲分裂，細(xì)胞核便發(fā)生融合，形成雜種細(xì)胞。細(xì)胞融合是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并成為一個(gè)具有雙核或多核細(xì)胞的過程。在自然情況下，體內(nèi)和體外培養(yǎng)的細(xì)胞均能發(fā)生自發(fā)融合現(xiàn)象。細(xì)胞融合已成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫，腫瘤及細(xì)胞工程的重要手段了解細(xì)胞融合的原理掌握用PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法

材料：雞,兔混合全血

試劑50%聚乙二醇(PEG,MW=4000)

GKN液Hanks溶液生理鹽水0.2%次甲基藍(lán)溶液抗凝劑:肝素溶液(250μg/ml)或Alsver液器材：顯微鏡，離心機(jī)，水浴鍋，電爐，量筒，離心管，注射器，試管，移液管，燒杯，吸管，載玻片，蓋玻片等。雞血準(zhǔn)備：用注射器吸入1mLAlsver液后從雞翼下靜脈取雞血2mL，注入刻度離心管內(nèi)，按照3：1(V／V)加入6mLAlsver液混勻，放入4℃冰箱內(nèi)可保存3--4天。兔血準(zhǔn)備混合血液取抗凝全血1mL，移入10mL離心管，

加入4mL0.85％生理鹽水混勻,洗滌,1500r/min離心5min。重復(fù)洗滌2次收集最后1次離心沉淀的血細(xì)胞，加入適量的GKN液或Ringer溶液，按壓積紅細(xì)胞體積配成5％的紅細(xì)胞懸液。取懸液1mL到試管中，加入37℃預(yù)熱的50％PEG0.8mL邊加邊搖動(dòng),在1min內(nèi)加完,充分混勻,靜置90秒.以室溫為對(duì)照加入GKN或Ringer或Hanks液5ml終止PEG的作用(在30℃下完成)鏡檢鏡檢取1滴PEG誘導(dǎo)后血細(xì)胞懸液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片,觀察細(xì)胞融合狀況.取1滴PEG誘導(dǎo)后血細(xì)胞懸液滴于載玻片上,再加入0.2%次甲基藍(lán)溶液1滴,蓋上蓋玻片,觀察細(xì)胞融合狀況計(jì)算融合率(%)融合率=融合細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%觀察時(shí)注意不同程度的融合現(xiàn)象。通常分為五個(gè)階段。①兩細(xì)胞膜接觸，粘連；②細(xì)胞膜形成穿孔；③兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)連通；④通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一體；⑤細(xì)胞完全合并，形成一個(gè)含有兩個(gè)或多個(gè)核的圓形細(xì)胞。

PEG誘導(dǎo),0.2%次甲基藍(lán)染色,雞血細(xì)胞融合情況以肝素抗凝血取代原方法中Alsver液鏡檢時(shí)以凹玻片取代普通載玻片準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞融合還是細(xì)胞重疊進(jìn)行染色處理提高分辨力利用光學(xué)顯微鏡或倒置顯微鏡(高倍)