熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)

熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)原位雜交(Insituhybridization)

1）同位素原位雜交(Isotopicinsituhybridization)

——70年代

2）非同位素原位雜交(Non-isotopicinsituhybridization)

——80年代中后期

（1）免疫酶聯(lián)

（2）熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)

**同位素原位雜交的不足之處：

1）不穩(wěn)定；

2）高背景；

3）曝光時(shí)間長(zhǎng)；

4）結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理繁瑣。5）同位素的使用和處理

第2頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)的基本原理:FISHisthedetectionofhighlyspecificDNAprobeswhichhavebeenhybridizedtoeitherinterphaseormetaphasechromosomesusingfluorescencemicroscopy.

第3頁,共32頁，2024年2月25日，星期天DNAforprobeuseislabeledwithfluorescent(directmethod)ornonfluorescentmoleculeswhicharethendetectedbyfluorescentantibodies(indirectmethod).Theprobesbindtoaspecificregionorregionsonthetargetchromosome.Thechromosomesarethenstainedusingacontrastingcolor,andthecellsareviewedusingafluorescencemicroscope.

第4頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共32頁，2024年2月25日，星期天**熒光原位雜交的特點(diǎn)：

1）快速；2）信號(hào)強(qiáng)；3）特異性高；4）多色。

**FISH有上述優(yōu)點(diǎn)的原因：

使用了熒光標(biāo)記與檢測(cè)系統(tǒng)取代放射性標(biāo)記與檢測(cè)系統(tǒng)

標(biāo)記探針的物質(zhì)：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin)

——半抗原報(bào)告分子（間接標(biāo)記）

（2）熒光物質(zhì)（直接標(biāo)記）

第8頁,共32頁，2024年2月25日，星期天FLUORESCENTlabeleddUTP

HAPTENElabeleddUTP

AMCA-6-dUTPCascadeBlue-4-dUTPFluorescein-12-dUTPRhodamine-6-dUTPTexasRed-6-dUTPCy3-6-dUTPCy5-dUTPBiotin(BIO)-11-dUTPDigoxygenin(DIG)-11-dUTPDinitrophenyl(DNP)-11-dUTP

第9頁,共32頁，2024年2月25日，星期天染色體復(fù)染的物質(zhì):

PropidiumIodide(PI)（紅色）DAPI（蘭色）quinacrine（綠色）chromomycineA3（綠色）

第10頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共32頁，2024年2月25日，星期天染色體“原位抑制”雜交（chromosomeinsitusuppression,

CISS)

克服散在的重復(fù)序列造成的雜交背景，提高信號(hào)的特異性，在探針中加入過量的未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性DNA(competitorDNA)，如humanCot-1DNA，進(jìn)行雜交前的預(yù)復(fù)性。探針中的重復(fù)序列與加入的競(jìng)爭(zhēng)物中的大量重復(fù)序列優(yōu)先復(fù)性，而特異性的單拷貝序列因競(jìng)爭(zhēng)物中同源序列拷貝數(shù)少，絕大部分仍保持單鏈狀態(tài)。

**FISH技術(shù)的應(yīng)用

1）基因（或DNA片段）的染色體定位；

2）染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)；

3）間期細(xì)胞遺傳學(xué)（絨毛/羊水/精子/卵裂球/其它間期細(xì)胞研究與診斷）；

4）腫瘤遺傳學(xué)研究第12頁,共32頁，2024年2月25日，星期天**用于FISH的探針

1）單拷貝探針：

（1）種類：YAC，BAC，Cosmid，Plasmid，cDNA片段

（2）應(yīng)用

（a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗(yàn)證；

（b）確定染色體微小缺失與重復(fù)；

（c）染色體斷裂點(diǎn)分析。

（d）間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷。第13頁,共32頁，2024年2月25日，星期天DNA片段的染色體定位第14頁,共32頁，2024年2月25日，星期天FISH檢測(cè)微小缺失第15頁,共32頁，2024年2月25日，星期天染色體片段重復(fù)Dup19(p13.2-13.1第16頁,共32頁，2024年2月25日，星期天21q22.2BAC克隆在Down綜合征間期細(xì)胞中的雜交信號(hào)第17頁,共32頁，2024年2月25日，星期天２）簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針(simplerepetitiveprobes)

——異染色質(zhì)著絲粒探針(heterochromaticcentromerprobes)

其靶序列為α衛(wèi)星DNA或衛(wèi)星IIIDNA(alphasatellite/satelliteIIIDNA)多位于染色體的著絲粒和異染色質(zhì)區(qū)域，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次。

特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)

應(yīng)用：(a)標(biāo)記染色體識(shí)別

(b)染色體數(shù)目異常檢測(cè)

(c)間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究和臨床診斷

第18頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共32頁，2024年2月25日，星期天**間期細(xì)胞遺傳學(xué)的意義：

細(xì)胞分裂期僅占整個(gè)細(xì)胞周期的幾分之一至幾十分之一，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和相應(yīng)處理才能獲得染色體。人體的大部分細(xì)胞并不進(jìn)行分裂，很難通過培養(yǎng)獲得中期染色體分裂相，間期FISH為這一時(shí)期遺期傳物質(zhì)的研究提供了可能，而且快速。第20頁,共32頁，2024年2月25日，星期天３）染色體涂染探針(chromosomepaintingprobes)

整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針

探針來源：

（1）含有人單條染色體的人-嚙齒類(human-rodent)體細(xì)胞雜種組織融合的產(chǎn)物；

（2）熒光激活的流式細(xì)胞儀(fluorescence-activatedcell

sorter,FACS)分離整條染色體DNA，并以載體克隆/PCR擴(kuò)增；

（3）顯微切割得到染色體或染色體片段，PCR擴(kuò)增；

應(yīng)用（1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析；

（2）不同物種間的同源性比較；

（3）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。

第21頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共32頁，2024年2月25日，星期天多色FISH（muti-colorFISH)

多色復(fù)合染色體FISH探針(multiplexFISH,M-FISH

probes)

#兩種以上不同的非同位素標(biāo)記，不同的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，通過不同的濾光片組合或極少數(shù)幾種非同位素標(biāo)記探針后，按照不同的比例混合，可以顯示多種顏色。第24頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)的基本操作步驟及時(shí)間安排一淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)及染色體標(biāo)本制備第一天（星期一）采血、接種（10:00）第二天（星期二）培養(yǎng)第三天（星期三）培養(yǎng)第四天（星期四）上午7:00加秋水仙素,(終濃度0.2ug/ml）至上午10:00結(jié)束培養(yǎng)制片，不染色，在顯微鏡下挑選分散良好的標(biāo)本。將選好的標(biāo)本放入50℃烤片。第26頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第五天（星期五）探針變性：75℃水浴5分鐘，立即置于0℃（冰浴中）5-10分鐘。玻片標(biāo)本變性：1.50℃溫箱中2小時(shí)2.標(biāo)本在70-75℃，70%甲酰胺/2XSSC中變性2-3分鐘。3.立即脫水，70-90-100%順序，各5分鐘。4.室溫干燥第27頁,共32頁，2024年2月25日，星期天原位雜交：將變性的DNA探針10ul滴于變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，Parafilm封片，置于濕盒中37℃雜交過夜。（15-17hr）

第五天實(shí)驗(yàn)結(jié)束第28頁,共32頁，2024年2月25日，星期天(第六天，星期六)洗脫、信號(hào)放大和免疫熒光檢測(cè)1.用刀片將蓋片揭起，輕輕移掉。2.45℃50%甲酰胺/2XSSC中洗3次，每次5分鐘。3.45℃1XSSC中洗3次，每次5分鐘。4.室溫下，2XSSC輕洗一下。5加180ul封閉液I，以薄膜蓋片，37℃溫育20分鐘，加入180ulavidin-FITC,37℃溫育45分鐘。6.取出標(biāo)本，45℃，4XSSC/0.1%Tween20中洗3次，每次5分鐘。第29頁,共32頁，2024年2月25日，星期天7加封閉液II,37℃溫育20分鐘。8加180ulantiavidin于標(biāo)本上，37℃45分鐘。9取出標(biāo)本，45℃，4XSSC/0.1%Tween20中洗3次，每次5分鐘。10加180ul封閉液I，37℃溫育20分鐘。11加180ul