蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)

第二章 蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)第一節(jié)

能用作純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì)第二節(jié)

蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟第三節(jié)

蛋白質(zhì)的分離純化方法分離純化蛋白質(zhì)的目的:①將蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)雜質(zhì)分離②將不同的蛋白質(zhì)相互分離。分離提純蛋白質(zhì)的要求：（1）純度

（2）活性（3）得率 （4）速度蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)第一節(jié)

能用作純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì)蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)1大小8密度2形狀9配體結(jié)合能力3電荷10金屬結(jié)合能力4等電點11可逆性締合5電荷分布12特異性序列或結(jié)構(gòu)6疏水性13非尋常性質(zhì)7溶解度14基因工程構(gòu)建的純化標(biāo)記1.

大小蛋白質(zhì)的大小各不相同，可從含幾個氨基酸的小肽（幾百個Da）至含10

000多個氨基酸（上百萬個Da）的巨大蛋白質(zhì)不等。多數(shù)蛋白質(zhì)的分子量在10

000—150

000Da之間。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)2.

形狀蛋白質(zhì)形狀有近似球形的，也有很不對稱的。在離心、凝膠過濾或凝膠電泳過程中都會受

到形狀的影響。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)3.

電荷蛋白質(zhì)的靜電荷取決于氨基酸殘基所帶正、負(fù)電荷的總和。一蛋白質(zhì)中，若天冬氨酸和谷氨酸殘基占優(yōu)勢，在pH7.0時帶凈負(fù)電荷，則稱之為酸性蛋白；若賴氨酸和精氨酸殘基占優(yōu)勢，則認(rèn)為是堿性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)4.

等電點等電點（pI）是蛋白質(zhì)上凈電荷為零時的pH值，由蛋白質(zhì)上帶正、負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)目和

滴定曲線所決定。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)電荷分布電荷的氨基酸可均勻地分布于蛋白質(zhì)的表面，亦可成簇地分布，使某一區(qū)域帶強(qiáng)的正電荷而另一區(qū)域帶強(qiáng)負(fù)電荷。這種非隨機(jī)的電荷分布可用來通過離子交換層析來分離蛋白質(zhì)。疏水性多數(shù)疏水性氨基酸殘基藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，但也有一些可見于表面。蛋白質(zhì)表面的疏

水性氨基酸殘基的數(shù)目和空間分布決定了

該蛋白質(zhì)是否具有與疏水柱填料結(jié)合從而

利用它來進(jìn)行分級分離的能力。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)溶解度蛋白質(zhì)在不同溶劑中的溶解度有很大不同，

從基本不溶（<10mg/ml)直至極易溶解（>300mg/ml)不等。影響蛋白質(zhì)溶解度的因素包括pH、離子強(qiáng)度、離子的性質(zhì)、溫度和溶劑的極性。蛋白質(zhì)在其等電點處一般較不易溶解。密度多數(shù)蛋白質(zhì)的密度在1.3—1.4g/cm3之間。分級分離蛋白質(zhì)時一般不用這個性質(zhì)。但是，在含有大量磷酸鹽（如卵黃高磷蛋白，密度為1.8）或脂質(zhì)部分（如脂蛋白，密度為1.03）的蛋白質(zhì)，與一般蛋白質(zhì)在密度上確有不同，可用密度梯度法將它們從大部分蛋白質(zhì)中分離出來。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)配體結(jié)合能力有許多酶能相當(dāng)緊地域底物、效應(yīng)分子、輔助因子和DNA模板?？衫糜H和層析分離金屬結(jié)合能力有許多酶能與某些金屬離子（如Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+和Ni2+)緊密結(jié)合。主要是其半胱氨酸或組氨酸殘基可與金屬離子作用，可通過金屬離子螯合柱將酶固定。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)可逆性締合在某些溶液條件下，有一些酶能聚集成二聚體、四聚體等。如大腸桿菌RNA聚合酶在0.05mol/LNaCl溶液中形成二聚體，在0.3mol/L NaCl溶液中為單體，可利用這一性質(zhì)，相繼在不同條件下按大小進(jìn)行分級分離。翻譯后修飾許多蛋白質(zhì)在合成后要通過加入糖基、?；⒘姿峄鶊F(tuán)或種種其他部分來進(jìn)行修飾。這些

修飾提供了可用于分級分離的依據(jù)。如糖蛋

白能與含有外援凝集素的柱子結(jié)合，外源凝

集素是一類能牢固地與某些糖基部分結(jié)合的

分子。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)特異性序列或結(jié)構(gòu)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)表面上的精確的幾何表象

可用來作為分離方法的基礎(chǔ)。例如，?？傻玫?/p>

只能識別蛋白質(zhì)上的特定部位（表位）的抗體。把只能與待分離蛋白質(zhì)結(jié)合的單特異性抗體連

接于填料上，可制備成免疫親和柱。非尋常性質(zhì)除上述各種性質(zhì)外，某些蛋白質(zhì)還有一些不尋常的性質(zhì)，如不尋常的熱穩(wěn)定性、抗蛋白酶解的抗性等。例如大腸桿菌堿性磷酸酯酶的純化，將細(xì)胞提取物加熱后離心去除凝結(jié)的蛋白質(zhì)，然后用蛋白酶處理含有磷酸酯酶的上清液，該酶消化剩余的雜蛋白，留下基本純凈的堿性磷酸酯酶。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)15.

基因工程構(gòu)建的純化標(biāo)記隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)步，克隆編碼某一蛋?質(zhì)的cDNA已變得比較容易。通過改變cDNA而在被表達(dá)蛋?質(zhì)的氨基端或羧基端加入少許幾個額外氨基酸，這個加入的“標(biāo)記”可用來作為一種有些的純化依據(jù)。最通行的標(biāo)記之一是在蛋白質(zhì)的氨基端加上

6—10個組氨酸，這樣可以使肽鏈能與Ni2+螯合柱緊密結(jié)合，經(jīng)洗脫，再用游離咪唑洗脫或通過將pH降至5.9，使組氨酸充分質(zhì)子化，與Ni2+分離而使蛋?質(zhì)得以純化。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)第二節(jié)

蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟（二）粗分級（三）細(xì)分級（一）前處理動物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)和脂肪組織；種子材料應(yīng)先去殼甚至去種

皮以免受單寧等物質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，將組織和細(xì)胞破碎。動物組織和細(xì)胞可用電動搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。（一）前處理1、選材2、破碎3、混合物的分離蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)（二）粗分級分離鹽析等電點沉淀有機(jī)溶劑分級分離超濾凝膠過濾（6)冷凍干燥蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)（三）細(xì)分級分離結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟。盡管結(jié)晶并不能保證蛋白質(zhì)一定是均一的，但只有某種蛋白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢時才能形成結(jié)晶。結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白質(zhì)。由于結(jié)晶中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純度的一個標(biāo)志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。一般使用層析法包括凝膠過濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等作為最后的純化步驟。用于細(xì)分級分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)第三節(jié)

蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)一、根據(jù)分子大小不同的純化方法二、利用溶解度差別的純化方法三、根據(jù)電荷不同的純化方法四、利用選擇性吸附的純化方法五、利用配體的特異性親和力的純化方法一、根據(jù)分子大小不同的純化方法蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)1.透析和超濾2.密度梯度離心3.凝膠層析1.透析和超濾透析——只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)

如無機(jī)鹽單糖等分開。常用

的半透膜：玻璃紙（賽璐玢紙，cellophane

paper）火綿紙（賽璐玎紙,celloidin

paper）其他改型纖維素材料蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)超濾（ultrafiltration）——除小分子雜質(zhì)，分離、濃縮蛋白質(zhì)加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液AB濾膜抽氣濾膜離心蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)2.密度梯度離心法（density

gradient）生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。品蔗糖密度梯度滴加樣離心管

蔗糖濃度蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)密度梯度離心滴加樣品4%塑料離心管8%12%16%20%分子量由小蔗糖濃度%—————

大蔗糖密度梯度（介質(zhì)還可用：氯化銫、甘油等）蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)以Au納米顆粒的分離的效果蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)膠體顆粒通過密度梯度超離心示意圖3.凝膠層析又叫分子篩層析。分子篩是具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。根據(jù)網(wǎng)孔不同可制成不同規(guī)格。具備條件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子篩：葡聚糖凝膠（Sephadex）型號：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15分離大蛋白質(zhì)、小蛋白質(zhì)，除鹽瓊脂糖凝膠（瑞典Sepharose、美國Bio-GelA）孔徑大，用于分離大分子物質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠（

Bio-GelP）蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)凝膠層析原理示意圖蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)分子篩層析與洗脫曲線凝膠顆收集蛋白管從柱上面加緩沖溶液洗脫體積（Ve）凝膠柱蛋白質(zhì)混合物粒

大分子

小分子質(zhì)大分子

小分子V0

Ve1

Ve2蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)洗液的白濃洗脫體積（mL）logM蛋白質(zhì)Mr=49,000r未知出中蛋質(zhì)度Andrews的經(jīng)驗公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“

選擇性曲線”量的關(guān)系G-200G-100logMrav洗脫體積與相對蛋白質(zhì)分分離純化子及實驗質(zhì)技術(shù)二、利用溶解度差別的純化方法蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)1.等電沉淀和pH控制2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析3.有機(jī)溶劑分級分離4.溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響1.等電沉淀和pH控制蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)蛋白質(zhì)處于等電點時，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他條件相同時，它的溶解度達(dá)到最低點。在等電點以上或以下的pH時，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號的凈電荷而相互排斥，阻止了單個分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。在其等電點(pH

5.2-5.3)時達(dá)到最低值，在等電點兩側(cè)的pH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點，利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。當(dāng)pH被調(diào)至蛋白質(zhì)混合物中某種成分的等電點pH時，這種蛋白質(zhì)的大部分或全部將沉淀下來，那些等電點高于或低于該

pH的蛋白質(zhì)則仍留在溶液中這樣沉淀出來的蛋白質(zhì)保持著

天然構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶(saltingin),鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析過程中往往沉淀析出，這就

是因為透析除去了鹽類離子，使蛋白質(zhì)分子間的相互吸引增加，

引起蛋白質(zhì)分子的凝集并沉淀。表明中性鹽對球狀蛋白質(zhì)的溶解

度有顯著的影響。3.有機(jī)溶劑分級分離蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)主要有乙醇、丙有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)沉淀酮、乙酸乙酯等。有機(jī)溶劑可以破壞水化膜、造成一個低介電區(qū)。有分級分離現(xiàn)象要求對有機(jī)溶劑低溫預(yù)冷。4.溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)在一定溫度范圍內(nèi)，約0-40℃之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加，但也有例外，例如人的血紅蛋白從0到25℃，溶解度隨溫度上升而降低。在40-50℃以上開始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在0 ℃或更低的溫度下進(jìn)行。三、根據(jù)電荷不同的純化方法蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)1.電泳概述2.聚丙烯酰胺凝膠電泳3.毛細(xì)管電泳4.等電聚焦5.層析聚焦6.離子交換層析1.電泳概述蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)電泳：根據(jù)支撐物分：根據(jù)電泳槽類型分：根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)特點分：據(jù)電泳槽類型分垂直板電泳毛細(xì)管電泳水平板電泳圓盤電泳蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)而成的。2.聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠(PAG)具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能起分子篩作用。用它作電泳支持物，對樣品的分離取決于各組分所帶電荷的多少及分子大小。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)還具有濃縮效應(yīng)，即在電泳開始階段，由于不連續(xù)pH梯度作用，將樣品壓縮成一條狹窄區(qū)帶，從而提高了分離效果。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠性質(zhì)加入分離膠溶

液

pH

8.8封水或飽和正丁醇溶液出倒出現(xiàn)水明或顯正界丁面醇時，，

并分用離膠濾凝紙聚吸完干成（３０min~１h）蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)制備分離膠封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。

凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。分離膠pH

8.8加入濃縮膠溶

液

pH

8.6制備濃縮膠樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。插入樣品梳蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)加入電極緩沖液pH

8.3濃縮膠pH6.8通電分離膠pH

8.8加入樣品蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)上樣及電泳開始電流恒定在10mA，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)3.毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳的原理蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)毛細(xì)管電泳

分離模式蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)毛細(xì)管區(qū)帶電泳膠束電動色譜毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管電色譜Waters

的CapLC-ESI-Q-Tof

Micro?毛細(xì)管液相-串級質(zhì)譜聯(lián)用儀蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)4.等電聚焦（isoelectric

focusing）原理:在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使應(yīng)用：高效率分離純化蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)pH不同化合物能按其各自等電點得到分離。pH10pH3pI1=

pH8pI2=

pH7pI3=

pH5-+線性梯度蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)5.聚焦層析

Chromatofocusing）pH梯度溶液的形成示意圖該法是在等電點聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時,由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中,一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的時

間進(jìn)行聚焦,剩余樣品還可以加到柱上,其聚焦過程都能順利完成。流速移動速率蛋白質(zhì)1（pI=7）

蛋白質(zhì)2（pI=8）層析時的聚焦效應(yīng)示意圖蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)6.

離子交換層析（ion-change

chromatography）原理基質(zhì)

疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應(yīng)用

制備純化生物物質(zhì)定量、定性測定混合物中各組分平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用1蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)2345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度離子交換層析原理示意圖蛋白質(zhì)濃度帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管收集樣品的管帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管NaClNaCl梯度蛋白洗質(zhì)分脫離體純化積及實驗技術(shù)梯度混合器蛋白質(zhì)混合物凝膠顆粒

大分子

小分子儲液瓶混合瓶層析柱磁力攪拌器洗脫劑濃度簡單型梯度混合器洗脫劑體積（mL）梯度洗脫曲線洗脫劑濃度蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)儲液瓶混合瓶復(fù)合型梯度混合器凸形線形凹形洗脫劑體積（mL）梯度洗脫曲線常用的陽離子交換劑離子交換劑可電離基團(tuán)

可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)CM-纖維素（弱酸型） 羧甲基P-纖維素（中強(qiáng)弱酸型）磷酸基SE-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺乙基SP-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺丙基蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)常用的陰離子交換劑離子交換劑可電離基團(tuán)

可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)AE-纖維素（弱減型）

氨基乙基PAB-纖維素（弱減型） 對氨基苯甲酸DEAE-纖維素

二乙基氨基乙基（中弱減型）DEAE-Sephadex

二乙基氨基乙基（中弱減型）DEAE

-纖維素（強(qiáng)減型）

二乙基氨基乙基QAE-纖維素（強(qiáng)減型）

二乙基（2-羥丙基）

-氨基乙基蛋白質(zhì)分離純化及實驗技術(shù)四、利用選擇性吸附的純化方法蛋白質(zhì)分離