DB32T4000-2021牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外 ELISA 法）

ICS11.220

CCSB41

DB32

江蘇省地方標準

DB32/T4000—2021

牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA

法）

DiagnosticTechniqueforBovineTuberculosisbyInterferon-gammaELISAAssay

2021-02-03發(fā)布2021-03-03實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T4000-2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件由揚州大學(xué)提出。

本文件由江蘇省畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。

本文件起草單位：揚州大學(xué)、江蘇省動物疫病預(yù)防控制中心。

本文件主要起草人：焦新安、陳祥、徐正中、潘志明、陳昌海、殷月蘭。

II

DB32/T4000-2021

牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）

1范圍

本文件規(guī)定了牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）的試劑及儀器、檢測方法、質(zhì)量控制和

結(jié)果判定等。

本文件適用于牛結(jié)核病診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T18645動物結(jié)核病診斷技術(shù)

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T32945牛結(jié)核病診斷體外檢測γ干擾素法

3術(shù)語和定義

本文件沒有特別需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

感染牛分枝桿菌的牛，其T淋巴細胞已被牛分枝桿菌致敏并產(chǎn)生免疫記憶。當體外再次遇到牛分枝

桿菌特異性抗原（結(jié)核菌素）刺激時，牛外周血中淋巴細胞被激活并大量釋放γ-干擾素，而未被感染的

牛則不會分泌或低水平分泌γ-干擾素。通過雙單克隆抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測特異性

γ-干擾素濃度水平，即可診斷牛結(jié)核病。

5試劑及儀器

5.1試劑

外周抗凝血培養(yǎng)所需材料參見附錄A。夾心ELISA所需試劑和材料參見附錄B。

5.2儀器

檢測所需儀器參見附錄C。

1

DB32/T4000-2021

6檢測方法

6.1試劑配制

檢測所需試劑的配制見附錄D。

6.2樣品采集與處理

6.2.1無菌采集牛尾靜脈血3mL～4mL，加入至含肝素鋰或肝素鈉的抗凝血真空管中，輕輕顛倒2次～

3次使血液和抗凝劑混合均勻。室溫（22±5℃）運送至實驗室并在采血后24h內(nèi)進行培養(yǎng)。

6.2.2分裝前輕輕顛倒抗凝血真空管，充分混勻血液樣品。將抗凝血無菌加入至48孔細胞培養(yǎng)板，

每頭?？鼓盅b3孔，1.0mL/孔（可參考表1）。

6.2.3在每頭牛的3孔抗凝血樣品中，分別無菌加入67μLPBS、67μL禽型PPD溶液和67μL牛

型PPD溶液（可參考表1），用微量振蕩器低速充分振蕩，使刺激抗原與抗凝血完全混合。

6.2.4蓋上細胞培養(yǎng)板蓋，避免液體揮發(fā)。將含有抗凝血和刺激抗原的48孔細胞培養(yǎng)板在37℃濕溫

培養(yǎng)箱中孵育16h～24h。

6.2.5使用移液器小心吸取上層血漿200μL～300μL，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。吸取血漿時應(yīng)盡量

避免吸入紅細胞。

表1.抗凝血樣品和刺激原加入到48孔細胞培養(yǎng)板（豎排放置）

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物1動物2

A1A2A3A4A5A6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物3動物4

B1B2B3B4B5B6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物5動物6

C1C2C3C4C5C6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物7動物8

D1D2D3D4D5D6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物9動物10

E1E2E3E4E5E6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物11動物12

F1F2F3F4F5F6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物13動物14

G1G2G3G4G5G6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物15動物16

H1H2H3H4H5H6

6.3酶聯(lián)免疫吸附試驗

6.3.1溶解陽性、陰性對照凍干粉，配制1×PBST洗滌液，按“操作注意事項”平衡其他試劑。

6.3.2取商品化已包被有γ-干擾素單克隆抗體的酶標板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），先加入50

μL樣品稀釋液至各孔中，再加入50μL血漿樣品及陽性對照、陰性對照至各孔中，輕輕振勻孔中樣品，

貼上封板膜，37℃孵育2h。

6.3.3棄去孔內(nèi)液體。使用1×PBST洗滌液洗板5次，300μL/孔。每次靜置1min后棄洗滌液，洗滌

完畢后在吸水紙上拍干。

2

DB32/T4000-2021

6.3.4用酶標抗體稀釋液按1：100稀釋酶標抗體（現(xiàn)配現(xiàn)用）。在每孔中加入100μL新鮮配制的酶標

抗體，貼上封板膜，37℃孵育2h。

6.3.5使用1×PBST洗滌液洗板5次，300μL/孔。每次靜置1min后棄洗滌液，洗滌完畢后在吸水紙

上拍干。

6.3.6每孔加入100μL底物顯色液，貼上封板膜，37℃避光顯色10min。

6.3.7按照加入底物顯色液的順序和時間間隔每孔加入50μL終止液，15min內(nèi)在酶標儀上測定

OD450nm。

6.4操作注意事項

6.4.1由于本試驗需要活的淋巴細胞，因此需要使細胞損傷降至最低。任何情況下不應(yīng)將抗凝血貯存于

冰箱中。

6.4.2刺激后的血漿樣品如不直接進行酶聯(lián)免疫吸附試驗，血漿可在2℃～8℃貯存7天，在-20℃可貯

存6個月。貯存前，每個貯存管必須用合適的蓋子密封。應(yīng)在樣品架上標記日期、操作者的首字母、

管內(nèi)容物、動物編號和牛群細節(jié)等相關(guān)信息。檢測前，樣品應(yīng)恢復(fù)至室溫并充分混勻。

6.4.3除酶標抗體外，試劑盒使用前各組份應(yīng)平衡至室溫，使用后即放回2℃～8℃。

6.4.4不同批號試劑盒的試劑組分不得混用，使用過程中各試劑組份應(yīng)避免交叉污染。

6.4.5底物顯色液避免暴露于強光和接觸氧化劑。

6.4.6終止液中含有H2SO4，使用時注意不要接觸到身體和衣物。

6.4.7抗體包被酶標板拆封后應(yīng)避免受潮或沾水（每次將剩余的抗體包被酶標板用封口袋扎緊后盡快置

于2℃~8℃）。

6.4.8陽性對照和陰性對照凍干粉用滅菌純水稀釋并使用后，盡快置于2℃～8℃保存。

6.4.9待檢血漿樣品數(shù)量較多時，可先使用樣品稀釋液稀釋完所有待檢血漿，再將稀釋好的血漿轉(zhuǎn)移到

反應(yīng)板，保證反應(yīng)時間一致。

6.4.10嚴格按照操作說明書要求進行，操作過程中移液、定時和洗滌等過程應(yīng)精確。

7質(zhì)量控制

在判定結(jié)果前必須檢查對照樣品的結(jié)果，確定陰性對照和陽性對照的OD450nm值在規(guī)定范圍之內(nèi)：

陰性對照OD450nm值范圍為0.0~0.15。

陽性對照OD450nm值范圍為0.7~3.0。

如果有一條標準不符合，試驗是無效的，應(yīng)重新進行檢測。

8結(jié)果判定

8.1計算每個樣品PBS刺激組、禽型PPD刺激組和牛型PPD刺激組的OD450nm值。如果做重復(fù)孔，應(yīng)

計算每頭牛所有樣品PBS刺激組、禽型PPD刺激組和牛型PPD刺激組的平均OD450nm值。

8.2結(jié)果判定標準

陽性判定標準：牛型PPD刺激組OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值≥0.1且牛型PPD刺激組OD450nm

值-禽型PPD刺激組OD450nm值≥0.1。

陰性判定標準：牛型PPD刺激組OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值＜0.1，或牛型PPD刺激組

OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值≥0.1且牛型PPD刺激組OD450nm值-禽型PPD刺激組OD450nm值＜0.1。

3

DB32/T4000-2021

9安全措施

按照GB/T18645和GB19489執(zhí)行。

4

DB32/T4000-2021

附錄A

（資料性）

外周抗凝血培養(yǎng)所需材料

A.1肝素鋰或肝素鈉真空抗凝管；

A.25mL或10mL動物采血器；

A.3無菌48孔細胞培養(yǎng)板；

A.4牛型PPD溶液（2.5mL/瓶）；

A.5禽型PPD溶液（2.5mL/瓶）；

A.6100μL、1000μL槍頭；

A.7用于貯存血漿的1.5mL離心管；

A.896孔板架。

5

DB32/T4000-2021

附錄B

（資料性）

夾心ELISA所需試劑和材料

B.1酶標板（包被牛γ-干擾素單克隆抗體，含0.1%ProClin300）；

B.2牛γ-干擾素陽性對照凍干粉（含0.1%ProClin300）；

B.3牛γ-干擾素陰性對照凍干粉（含0.1%ProClin300）；

B.4樣品稀釋液（血漿稀釋緩沖液，含0.1%ProClin300）；

B.5PBST洗滌液（20×）（含0.1%ProClin300）；

B.6酶標抗體（含0.1%ProClin300）；

B.7酶標抗體稀釋液（含0.01%的硫柳汞）；

B.8底物顯色液（TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）溶液）；

B.9終止液（0.5MH2SO4）；

B.10滅菌純水（用于溶解陽性對照、陰性對照凍干粉）；

B.11蒸餾水（用于稀釋洗液）；

B.12酶聯(lián)免疫吸附試驗所需的試劑、反應(yīng)槽、封板膜和槍頭。

6

DB32/T4000-2021

附錄C

（資料性）

檢測所需儀器

C.137℃濕溫培養(yǎng)箱；

C.2精密可調(diào)移液器（100μL、1000μL）；

C.31mL、5mL、10mL的移液器；

C.4100mL、1L、2L的量筒；

C.512道移液器（50μL～300μL）；

C.6微量振蕩器（可選）；

C.7洗板機（可選）；

C.837℃水浴鍋；

C.9酶標儀（含450nm濾光片）。

7

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附錄D

（規(guī)范性）

檢測所用試劑的配制

D.1刺激抗原

牛型PPD溶液（10000IU/mL）和禽型PPD溶液（7500IU/mL）在使用前徹底混勻，2.5mL/瓶。

D.2酶標板

在開封前將酶標板恢復(fù)至室溫，可放置30min以上。

D.3陽性對照和陰性對照

用0.2mL滅菌純水分別溶解陰、陽性對照凍干粉。應(yīng)保證完全溶解，溶解的陽性對照、陰性對照

在2℃～8℃可儲存1個月，但再次使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫并充分混勻。

D.4樣品稀釋液

恢復(fù)至室溫并充分混勻，用作血漿稀釋緩沖液。

D.5酶標抗體和酶標抗體稀釋液

酶標抗體必須一直保存于2℃～8℃。酶標抗體稀釋液可直接使用。按表2配制酶標抗體工作液，

現(xiàn)配現(xiàn)用，未用完的試劑應(yīng)立即丟棄。未用完的酶標抗體應(yīng)立即放回至2℃～8℃條件下保存。

表2酶標抗體工作液配制表

酶標板數(shù)量酶標抗體的體積酶標抗體稀釋液的體積

10.11mL11mL

D.6洗滌液

配制工作濃度的洗滌液，將19份蒸餾水加入1份20倍濃縮的洗滌液中，充分混勻。工作濃度的洗

滌液可在室溫貯存2周，未用完的20倍濃縮洗滌液應(yīng)放回至2℃～8℃條件下保存。20倍濃縮洗液可能

含有結(jié)晶鹽，使用前37℃重新溶解結(jié)晶。

__________________________

8

DB32/T4000-2021

目次

前言..............................................................................Ⅱ

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義.........................................................................1

4原理...............................................................................2

5試劑及儀器.........................................................................2

6檢測方法...........................................................................2

7質(zhì)量控制...........................................................................3

8結(jié)果判定...........................................................................4

9安全措施...........................................................................4

附錄A（資料性）外周抗凝血培養(yǎng)所需材料..............................................5

附錄B（資料性）夾心ELISA所需試劑和材料............................................6

附錄C（資料性）檢測所需儀器........................................................7

附錄D（規(guī)范性）檢測所用試劑的配制..................................................8

I

DB32/T4000-2021

牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）

1范圍

本文件規(guī)定了牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）的試劑及儀器、檢測方法、質(zhì)量控制和

結(jié)果判定等。

本文件適用于牛結(jié)核病診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T18645動物結(jié)核病診斷技術(shù)

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T32945牛結(jié)核病診斷體外檢測γ干擾素法

3術(shù)語和定義

本文件沒有特別需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

感染牛分枝桿菌的牛，其T淋巴細胞已被牛分枝桿菌致敏并產(chǎn)生免疫記憶。當體外再次遇到牛分枝

桿菌特異性抗原（結(jié)核菌素）刺激時，牛外周血中淋巴細胞被激活并大量釋放γ-干擾素，而未被感染的

牛則不會分泌或低水平分泌γ-干擾素。通過雙單克隆抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測特異性

γ-干擾素濃度水平，即可診斷牛結(jié)核病。

5試劑及儀器

5.1試劑

外周抗凝血培養(yǎng)所需材料參見附錄A。夾心ELISA所需試劑和材料參見附錄B。

5.2儀器

檢測所需儀器參見附錄C。

1

DB32/T4000-2021

6檢測方法

6.1試劑配制

檢測所需試劑的配制見附錄D。

6.2樣品采集與處理

6.2.1無菌采集牛尾靜脈血3mL～4mL，加入至含肝素鋰或肝素鈉的抗凝血真空管中，輕輕顛倒2次～

3次使血液和抗凝劑混合均勻。室溫（22±5℃）運送至實驗室并在采血后24h內(nèi)進行培養(yǎng)。

6.2.2分裝前輕輕顛倒抗凝血真空管，充分混勻血液樣品。將抗凝血無菌加入至48孔細胞培養(yǎng)板，

每頭?？鼓盅b3孔，1.0mL/孔（可參考表1）。

6.2.3在每頭牛的3孔抗凝血樣品中，分別無菌加入67μLPBS、67μL禽型PPD溶液和67μL牛

型PPD溶液（可參考表1），用微量振蕩器低速充分振蕩，使刺激抗原與抗凝血完全混合。

6.2.4蓋上細胞培養(yǎng)板蓋，避免液體揮發(fā)。將含有抗凝血和刺激抗原的48孔細胞培養(yǎng)板在37℃濕溫

培養(yǎng)箱中孵育16h～24h。

6.2.5使用移液器小心吸取上層血漿200μL～300μL，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。吸取血漿時應(yīng)盡量

避免吸入紅細胞。

表1.抗凝血樣品和刺激原加入到48孔細胞培養(yǎng)板（豎排放置）

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物1動物2

A1A2A3A4A5A6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物3動物4

B1B2B3B4B5B6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物5動物6

C1C2C3C4C5C6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物7動物8

D1D2D3D4D5D6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物9動物10

E1E2E3E4E5E6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物11動物12

F1F2F3F4F5F6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物13動物14

G1G2G3G4G5G6

PBS禽型PPD牛型PPDPBS禽型PPD牛型PPD

動物15動物16

H1H2H3H4H5H6

6.3酶聯(lián)免疫吸附試驗

6.3.1溶解陽性、陰性對照凍干粉，配制1×PBST洗滌液，按“操作注意事項”平衡其他試劑。

6.3.2取商品化已包被有γ-干擾素單克隆抗體的酶標板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），先加入50

μL樣品稀釋液至各孔中，再加入50μL血漿樣品及陽性對照、陰性對照至各孔中，輕輕振勻孔中樣品，

貼上封板膜，37℃孵育2h。

6.3.3棄去孔內(nèi)液體。使用1×PBST洗滌液洗板5次，300μL/孔。每次靜置1min后棄洗滌液，洗滌

完畢后在吸水紙上拍干。

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DB32/T4000-2021

6.3.4用酶標抗體稀釋液按1：100稀釋酶標抗體（現(xiàn)配現(xiàn)用）。在每孔中加入100μL新鮮配制的酶標

抗體，貼上封板膜，37℃孵育2h。

6.3.5使用1×PBST洗滌液洗板5次，300μL/孔。每次靜置1min后棄洗滌液，洗