酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)

酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)章節(jié)目錄一、酶的活性部位二、酶催化反應(yīng)的獨(dú)特性質(zhì)三、影響酶催化效率的有關(guān)因素四、酶催化反應(yīng)機(jī)制的實(shí)例五、酶活性的調(diào)節(jié)控制六、同工酶第2頁,共68頁，2024年2月25日，星期天一、酶的活性部位

（一）酶活性部位的特點(diǎn)

胰凝乳蛋白酶與底物的結(jié)合活性部位在酶分子的總體積中只占相當(dāng)小的部分酶的活性部位是一個三維實(shí)體酶的活性部位并不是和底物的形狀正好互補(bǔ)的，它們是通過誘導(dǎo)契合的過程使兩者互補(bǔ)酶的活性部位是位于酶分子表面的一個裂縫內(nèi)底物通過次級鍵較弱的力結(jié)合到酶上酶活性部位具有柔性或可運(yùn)動性第3頁,共68頁，2024年2月25日，星期天酶活性部位的特點(diǎn)

胰凝乳蛋白酶的結(jié)構(gòu)

第4頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

酶氨基酸殘基數(shù)活性部位的氨基酸殘基

核糖核酸鎂A124His12，His119，Lys41

溶菌鎂129Asp52，Glu35

胰凝乳蛋白酶241Asp57，Asp102，Ser195

胰蛋白酶223Asp57，Asp102，Ser195

彈性蛋白酶240Asp57，Asp102，Ser195

胃蛋白酶348Asp32，Asp215HIV-1蛋白酶99×2Asp25

木瓜蛋白酶212Cys25，His159

枯草桿菌蛋白酶275His64，Ser221，Asp32

碳酸酐酶259His94-Zn-Lys96His119

羧肽酶A307Arg127，Glu270，Tyr248，Zn2+

旰乙醇脫氫酶374×2Ser48，His51，NAD+，Zn2+某些酶活性部位的氨基酸殘基

第5頁,共68頁，2024年2月25日，星期天1酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾法（1）非特異性共價修飾（2）特異性共價修飾（3）親和標(biāo)記法2動力學(xué)參數(shù)測定法3X射線晶體結(jié)構(gòu)分析法4定點(diǎn)誘變法研究酶活性部位的方法(1)第6頁,共68頁，2024年2月25日，星期天酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾法

用帶標(biāo)記的化合物與酶的活性部位氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)共價結(jié)合，然后水解該酶，分離出帶有標(biāo)簽的肽段，即可分析出活性部位的氨基酸殘基。化學(xué)試劑已和活性部位基團(tuán)結(jié)合的鑒定標(biāo)準(zhǔn)：其一：酶活力的喪失程度和修飾劑濃度成一定的比例關(guān)系其二：底物或活性部位結(jié)合的可逆抑制劑可保護(hù)共價修飾劑的抑制作用

如果某些基團(tuán)修飾后不引起酶活力的變化，可以初步認(rèn)為，此基團(tuán)可能是非必需基團(tuán)。如果某些基團(tuán)修飾后引起酶活力的變化，則此基團(tuán)可能是酶的必需基團(tuán)。特異性共價修飾研究酶活性部位的方法(2)第7頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

定點(diǎn)誘變法

根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的結(jié)果，可以利用定點(diǎn)誘變技術(shù)，改變編碼蛋白質(zhì)基團(tuán)中的DNA順序，研究酶活力部位的必需氨基酸如果被代換的氨基酸不影響酶的活性，則該位置的氨基酸殘基不是必需基團(tuán)如果被代換的氨基酸使酶活性喪失或降低，則該位置的原有氨基酸殘基是必需基團(tuán)

①Vmax不變，Km值升高，該位置氨基酸為結(jié)合基團(tuán)②Vmax降低，Km值不變，該位置氨基酸為催化基團(tuán)

③酶活性完全喪失，該位置氨基酸為必需基團(tuán)

研究酶活性部位的方法(3)第8頁,共68頁，2024年2月25日，星期天（1）酶反應(yīng)可以分為兩類，一類反應(yīng)僅僅涉及到電子的轉(zhuǎn)移，另一類反應(yīng)涉及到電子和質(zhì)子兩者或其他基團(tuán)的轉(zhuǎn)移（2）酶的催化作用是由氨基酸側(cè)鏈上的功能基團(tuán)和輔酶為媒介的（3）酶催化反應(yīng)的最適pH范圍通常狹?。?）與底物相比較，酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些（5）酶除了具有進(jìn)行催化反應(yīng)所必需的活性基團(tuán)外，還有別的特性

①在活性部位存在1個以上的催化基團(tuán)，所以能進(jìn)行協(xié)同催化

②存在結(jié)合部位，因此底物分子可以以反應(yīng)中固有的方位結(jié)合在活性部位附近

③在包含有2個或2個以上底物分子參加反應(yīng)的情況中，存在著一個以上的底物分子結(jié)合的部位

④底物以某種方式結(jié)合到酶分子上，使底物分子中的鍵產(chǎn)生張力，從而有利于過渡態(tài)復(fù)合物的形成二、酶催化反應(yīng)的獨(dú)特性質(zhì)第9頁,共68頁，2024年2月25日，星期天鄰近效應(yīng)

酶與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物以后，使底物和底物之間，酶的催化基團(tuán)與底物之間結(jié)合與同一分子而使有效濃度得以極大的升高，從而使反應(yīng)速率大大增加。

三、影響酶催化效率的有關(guān)因素第10頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)之間和酶的催化基團(tuán)與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間的正確取位產(chǎn)生的效應(yīng)

由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子與反應(yīng)的基團(tuán)相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點(diǎn)。定向反應(yīng)(1)第11頁,共68頁，2024年2月25日，星期天二羧酸單苯酯水解相對速率和結(jié)構(gòu)關(guān)系

定向反應(yīng)(2)第12頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

酶與底物相互接近時，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互形變進(jìn)而相互結(jié)合

酶的構(gòu)象改變有利于與底物結(jié)合；底物在酶誘導(dǎo)下發(fā)生形變，處于不穩(wěn)定狀態(tài)（過渡態(tài)），易受催化基團(tuán)的攻擊過渡態(tài)的底物與酶的活性中心結(jié)構(gòu)最吻合誘導(dǎo)契合第13頁,共68頁，2024年2月25日，星期天酸堿催化是通過瞬時的向反應(yīng)物提供質(zhì)子或從反應(yīng)物接受質(zhì)子以穩(wěn)定過渡態(tài)，加速反應(yīng)的一類催化機(jī)制。專一的酸堿催化（狹義的酸堿催化）：在水溶液中通過高反應(yīng)性的質(zhì)子和氫氧離子進(jìn)行的催化反應(yīng)總酸堿催化（廣義的酸堿催化）：通過H+和OH-以及能提供

H+及OH-的供體進(jìn)行的催化反應(yīng)緩沖液濃度緩沖液濃度kobs

kobs

pH8pH6pH7pH8pH7pH6酸堿催化（1）第14頁,共68頁，2024年2月25日，星期天酶分子中可作為總酸堿催化的功能基團(tuán)

氨基酸殘基廣義酸基團(tuán)（質(zhì)子供體）廣義堿基團(tuán)（質(zhì)子受體）酸堿催化（2）第15頁,共68頁，2024年2月25日，星期天胰凝乳蛋白酶通過酸堿催化使肽鍵斷裂水解酸堿催化（3）第16頁,共68頁，2024年2月25日，星期天在催化時，親核催化劑或親電子催化劑能分別放出電子或汲取電子并作用于底物的缺電子中心或負(fù)電子中心，迅速形成不穩(wěn)定的共價中間復(fù)合物，降低反應(yīng)活化能，使反應(yīng)加速

EXEX:YX+Y-EER-O-P-OR'O-OOR-O-P-OR'-OEX-OR-O-P-XO+R'O---磷酰酶

葡萄酶

共價催化第17頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

需要金屬的酶可以分為：金屬酶和金屬-激活酶兩類

金屬離子以3種主要途徑參加催化過程（1）通過結(jié)合底物為反應(yīng)定向（2）通過可逆地改變金屬離子的氧化態(tài)調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)（3）通過靜電穩(wěn)定或屏蔽負(fù)電荷金屬離子催化（1）第18頁,共68頁，2024年2月25日，星期天金屬離子催化（2）第19頁,共68頁，2024年2月25日，星期天金屬離子催化（2）第20頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

在酶催化反應(yīng)中，常常是幾個基元催化反應(yīng)配合在一起共同起作用。例如胰凝乳蛋白酶是通過Asp102、His57

、Ser195

組成的“電荷中繼網(wǎng)”催化肽鍵水解，包括親核催化和堿催化共同作用。這種多元催化協(xié)同作用的結(jié)果是使酶加速的一個因素。多元催化和協(xié)同效應(yīng)第21頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

酶分子表面有一個裂縫，活性部位就位于疏水環(huán)境的裂縫中。在非極性環(huán)境中的介電常數(shù)較在水介質(zhì)的介電常數(shù)低。在非極性環(huán)境中兩個帶電基團(tuán)之間的靜電作用比在極性環(huán)境中顯著增高活性部位微環(huán)境的影響

胰凝乳蛋白酶第22頁,共68頁，2024年2月25日，星期天四、酶催化反應(yīng)機(jī)制的實(shí)例第23頁,共68頁，2024年2月25日，星期天溶菌酶(2)第24頁,共68頁，2024年2月25日，星期天溶菌酶催化作用溶菌酶(3)第25頁,共68頁，2024年2月25日，星期天溶菌酶催化作用溶菌酶(4)第26頁,共68頁，2024年2月25日，星期天胰核糖核酸酶A（1）第27頁,共68頁，2024年2月25日，星期天胰核糖核酸酶A（2）第28頁,共68頁，2024年2月25日，星期天A.

酶切法①用枯草桿菌蛋白酶限制性水解20-21氨基酸殘基間肽鍵，得到

S肽（20肽）和S蛋白（104肽），兩者均無活性②S肽與S蛋白在中性pH共同保溫，可恢復(fù)活性③人工合成S肽氨基端的13個氨基酸與S蛋白共同保溫，可恢復(fù)70%活性④去除人工肽His12和Met13的S肽，共同保溫不能恢復(fù)活性B.

化學(xué)修飾法①碘乙酸修飾His119和His12，酶失活②酶與胞嘧啶核苷3‘-磷酸抑制劑結(jié)合，碘乙酸不能在修飾③2，4-二硝基氟苯修飾Lys41，酶失活C.

結(jié)論：活性中心由His119、His12、Lys41構(gòu)成胰核糖核酸酶A（3）第29頁,共68頁，2024年2月25日，星期天羧肽酶A(1)第30頁,共68頁，2024年2月25日，星期天羧肽酶A(2)第31頁,共68頁，2024年2月25日，星期天羧肽酶A(3)第32頁,共68頁，2024年2月25日，星期天絲氨酸蛋白酶是一類最有特色的酶家族，這個家族包括：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶、枯草桿菌蛋白酶、纖溶酶、組織纖溶酶原激活劑消化酶，在胰腺中合成，在消化道中通過除去部分肽鏈轉(zhuǎn)變成活性酶形式在血凝級聯(lián)中是一個重要的酶

一種細(xì)菌蛋白酶裂解血凝塊的纖維多聚體特異地裂解纖溶酶原產(chǎn)生纖溶酶乙酰膽堿酯酶絲氨酸酯酶，能降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿絲氨酸蛋白酶(1)第33頁,共68頁，2024年2月25日，星期天絲氨酸蛋白酶(2)第34頁,共68頁，2024年2月25日，星期天絲氨酸蛋白酶通過共價催化和廣義酸堿催化的混合方式進(jìn)行絲氨酸蛋白酶(3)第35頁,共68頁，2024年2月25日，星期天酶活性部位位于酶分子表面凹陷的小口袋中絲氨酸蛋白酶(4)第36頁,共68頁，2024年2月25日，星期天用于研究胰凝乳蛋白酶機(jī)制的人工底物絲氨酸蛋白酶(5)第37頁,共68頁，2024年2月25日，星期天時滯釋放的乙酸或p硝基苯酚的量時間胰凝乳蛋白酶兩階段反應(yīng)機(jī)制穩(wěn)態(tài)階段突發(fā)階段p硝基苯酚乙酸絲氨酸蛋白酶(6)第38頁,共68頁，2024年2月25日，星期天胰凝乳蛋白酶酶-底物復(fù)合物

疏水口袋催化三聯(lián)體活性部位

底物（一種多肽）胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制

絲氨酸蛋白酶(7)第39頁,共68頁，2024年2月25日，星期天②Ser195-OH的O與肽鍵的羰基C共價結(jié)合，H結(jié)合于His57的N上胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制

絲氨酸蛋白酶(8)第40頁,共68頁，2024年2月25日，星期天③產(chǎn)物1His提供H給肽鍵的N形成-NH2，肽鍵斷裂，釋放第一個產(chǎn)物胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制

絲氨酸蛋白酶(9)第41頁,共68頁，2024年2月25日，星期天加水，His-N攻擊H2O的H，OH-的O攻擊羰基C

胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制

絲氨酸蛋白酶(10)第42頁,共68頁，2024年2月25日，星期天⑤His-N攻擊H2O的H，H2O裂解，OH-的O攻擊羰基C胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制

絲氨酸蛋白酶(11)第43頁,共68頁，2024年2月25日，星期天⑥His-NH提供H給Ser的O，第二個產(chǎn)物形成，但仍與酶結(jié)合胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制

絲氨酸蛋白酶(12)第44頁,共68頁，2024年2月25日，星期天⑦第二個產(chǎn)物釋放，酶再生胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制

絲氨酸蛋白酶(13)第45頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

名稱來源功能

天冬氨酸酶的某些代表

胃蛋白酶動物胃消化飲食蛋白

凝乳酶動物胃消化飲食蛋白

組織蛋白酶脾、肝和許多其他動物組織溶酶體蛋白消化

腎素腎轉(zhuǎn)換血管緊張肽原成為血管緊張肽Ⅰ

調(diào)節(jié)血壓HIV-1蛋白酶AIDS病毒加工AIDS病毒蛋白

天冬氨酸蛋白酶(1)第46頁,共68頁，2024年2月25日，星期天天冬氨酸蛋白酶(2)第47頁,共68頁，2024年2月25日，星期天天冬氨酸蛋白酶的機(jī)制天冬氨酸蛋白酶(3)第48頁,共68頁，2024年2月25日，星期天天冬氨酸蛋白酶(4)第49頁,共68頁，2024年2月25日，星期天天冬氨酸蛋白酶(5)第50頁,共68頁，2024年2月25日，星期天（一）別構(gòu)調(diào)控

酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象的改變，進(jìn)而改變酶活性狀態(tài)，稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)具有這種別構(gòu)調(diào)節(jié)作用的酶稱為別構(gòu)酶凡是能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)稱為效應(yīng)物（別構(gòu)劑）因別構(gòu)導(dǎo)致酶活性增加的物質(zhì)稱正效應(yīng)物（別構(gòu)激活劑）因別構(gòu)導(dǎo)致酶活性降低的物質(zhì)稱負(fù)效應(yīng)物（別構(gòu)抑制劑）代謝底物經(jīng)常是別構(gòu)酶的別構(gòu)激活劑，代謝產(chǎn)物往往是別構(gòu)抑制劑別構(gòu)酶通常是寡聚酶五、酶活性的調(diào)節(jié)控制第51頁,共68頁，2024年2月25日，星期天別構(gòu)調(diào)控(2)第52頁,共68頁，2024年2月25日，星期天L-蘇氨酸L-異亮氨酸蘇氨酸脫水酶異亮氨酸的合成別構(gòu)調(diào)控(3)第53頁,共68頁，2024年2月25日，星期天底物

變構(gòu)激活劑

催化亞基調(diào)節(jié)亞基活性較高的酶

高活性酶-底物復(fù)合物

活性較低的酶

別構(gòu)激活模型別構(gòu)調(diào)控(4)第54頁,共68頁，2024年2月25日，星期天A

B

ATCase中亞基的排列

A.ATCase三重對稱軸的俯視B.ATCase的垂直觀別構(gòu)調(diào)控(5)第55頁,共68頁，2024年2月25日，星期天別構(gòu)調(diào)控(6)第56頁,共68頁，2024年2月25日，星期天312正、負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶與非別構(gòu)酶的動力學(xué)曲線比較

1、非別構(gòu)酶2、正協(xié)同3、負(fù)協(xié)同

別構(gòu)調(diào)控(7)第57頁,共68頁，2024年2月25日，星期天A123B321A為K型效應(yīng)物，B為V型效應(yīng)物

1、未加效應(yīng)物2、加激活劑3、加抑制劑別構(gòu)調(diào)控(8)第58頁,共68頁，2024年2月25日，星期天別構(gòu)模型別構(gòu)酶的齊變模型別構(gòu)酶的序變模型別構(gòu)調(diào)控(9)第59頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

合成部位酶原有活性的酶

胰臟彈性蛋白酶原彈性蛋白酶[酶原]

某些活性酶的無活性前體蛋白（如果不是酶，則稱某蛋白原），這種前體蛋白經(jīng)過蛋白水解酶專一作用后，構(gòu)象發(fā)生變化，形成酶的活性部位，變成活性蛋白[酶原激活的本質(zhì)]

活性中心的形成或暴露過程

胃胃蛋白酶原胃蛋白酶

胰臟胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶

胰臟胰蛋白酶原胰蛋白酶