酶工程在生物技術(shù)上的應(yīng)用省公開(kāi)課金獎(jiǎng)全國(guó)賽課一等獎(jiǎng)微課獲獎(jiǎng)

酶在生物技術(shù)上應(yīng)用北京師范大學(xué)珠海分校12生物技術(shù)2班1/74目錄2酶在去除細(xì)胞壁上應(yīng)用酶在蛋白質(zhì)測(cè)序上應(yīng)用酶在大分子測(cè)序上應(yīng)用氫化酶在生物制氫上應(yīng)用2/74Chapter.1酶在除去細(xì)胞壁應(yīng)用過(guò)渡頁(yè)

TRANSITIONPAGE3/74Chp1植物細(xì)胞壁Chp2細(xì)菌細(xì)胞壁Chp3酵母細(xì)胞壁Chp4霉菌細(xì)胞壁主要內(nèi)容

CONTENTSPAGE4/74微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞表層。細(xì)胞壁對(duì)微生物和植物維持其細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)起著主要作用，可保護(hù)細(xì)胞免遭外界原因破壞。但在生物工程方面，很多時(shí)候都要去除細(xì)胞壁。介紹

TRANSITIONPAGE5/74一細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)提?。何⑸锖图?xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)，如胰島素，干擾素等基因工程菌產(chǎn)物天然抗氧劑等植物細(xì)胞代謝物等都存在細(xì)胞內(nèi)。為了將這些物質(zhì)提取出來(lái)，很多時(shí)候都需要把細(xì)胞壁破壞或者除去。介紹

TRANSITIONPAGE二原生質(zhì)體制備：除去細(xì)胞壁后由細(xì)胞膜和胞內(nèi)物質(zhì)組成微球體成為原生質(zhì)體。在制備原生質(zhì)體或者提取一些穩(wěn)定性較差活性物質(zhì)時(shí)候，既要除去細(xì)胞壁，又不能損傷其它成份。這么就不能采取激烈破碎方法，而只能利用各種含有專一性酶。6/74去除植物細(xì)胞壁細(xì)胞壁組分是紡織、造紙、木材、膠片、增稠劑及其它工業(yè)產(chǎn)品主要原料。植物細(xì)胞壁生物合成過(guò)程是植物生長(zhǎng)發(fā)育中最主要合成代謝之一，也是植物光合作用產(chǎn)物主要貯積方式。破除植物細(xì)胞壁主要采取纖維素酶，半纖維素酶和果膠酶組成混合酶。這幾個(gè)酶大多數(shù)由霉菌發(fā)酵產(chǎn)生。7/74細(xì)菌細(xì)胞壁由一些化學(xué)成份不一樣物質(zhì)組成，如肽聚糖、磷壁酸、脂多糖、磷脂、外膜蛋白等，在這些組成成份中對(duì)細(xì)胞壁生理功效起主要作用是肽聚糖，除少數(shù)細(xì)菌如產(chǎn)甲烷細(xì)菌這類古細(xì)菌細(xì)胞壁是由其它化學(xué)物質(zhì)組成外，幾乎全部細(xì)菌細(xì)胞壁都含有肽聚糖，在G+細(xì)菌中肽聚糖含量高達(dá)30%～95%，G－細(xì)菌也有5%～20%含量。細(xì)菌細(xì)胞壁

TRANSITIONPAGE8/74細(xì)菌細(xì)胞壁

TRANSITIONPAGE除去細(xì)菌細(xì)胞壁是采取從蛋清中分離溶菌酶。9/74細(xì)菌細(xì)胞壁

TRANSITIONPAGE合成溶菌酶工藝流程圖10/74溶菌酶能專一地作用于細(xì)菌細(xì)胞壁肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間a-1，4-鍵。而對(duì)于革蘭氏陰性菌需要由溶霉菌和EDTA共同作用才能到達(dá)很好除去細(xì)胞壁效果。這是因?yàn)镋DTA可作用于脂多糖。細(xì)菌細(xì)胞壁

TRANSITIONPAGE11/74酵母細(xì)胞壁厚度為0.1~0.3μm，重量占細(xì)胞干重18%~30%，主要由D-葡聚糖和D-甘露聚糖兩類多糖組成，含有少許蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)。酵母細(xì)胞壁去除12/74葡聚糖酶：β-葡聚糖酶（β-1,3-1,4葡聚糖酶）。它是采取BacillusLichenifomis菌株經(jīng)過(guò)液態(tài)深層發(fā)酵制得，該酶是一個(gè)內(nèi)切酶，專一作用于β-葡聚糖1,3及1,4糖苷鍵，產(chǎn)生3-5個(gè)葡萄糖單位低聚糖及葡萄糖。葡聚糖酶13/74霉菌細(xì)胞壁霉菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。不一樣種屬霉菌，其細(xì)胞壁組分和結(jié)構(gòu)有較大差異。所以，若要除去霉菌細(xì)胞壁，需要搞清屬于什么霉菌，再選取適宜幾個(gè)酶共同作用，才能到達(dá)很好破壁效果。14/74藻菌綱霉菌半知菌綱霉菌毛酶，根霉等細(xì)胞壁主要由幾丁質(zhì)和殼多糖等各種物質(zhì)組成。破壁主要采取放線菌或細(xì)菌產(chǎn)生克多糖酶和幾丁質(zhì)以及蛋白酶等各種酶混合物。這些混合多酶試劑普通稱為細(xì)胞壁溶解酶。米曲霉，黑曲霉等細(xì)胞壁主要由幾丁質(zhì)，葡聚糖組成。破壁時(shí)主要采取幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶混合物。15/74Chapter.2酶在蛋白質(zhì)測(cè)序上應(yīng)用——羧肽酶A過(guò)渡頁(yè)

TRANSITIONPAGE16/74羧肽酶

Carboxypeptidase，CP1、羧肽酶介紹羧肽酶是一個(gè)專一性地從肽鏈Ｃ端逐一降解、釋放游離氨基酸一類肽鏈外切酶。依據(jù)反應(yīng)底物不一樣，可分為A、B、C和Y四類。17/74羧肽酶A18/742、羧肽酶A1、外形緊密，是一個(gè)5.0nm×4.2nm×3.8nm橢圓形球體，大約含有38%α螺旋，17%β折疊片；2、分子量約為35kD；3、由307個(gè)氨基酸殘基組成；4、等電點(diǎn)為6.0；5、存在于哺乳動(dòng)物胰臟；6、是一類水解蛋白和多肽底物C端芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸殘基消化酶。

19/743、羧肽酶A活性中心

精氨酸殘基金屬Zn2+酪氨酸殘基20/743、羧肽酶A活性中心

精氨酸殘基金屬Zn2+酪氨酸殘基21/743、羧肽酶A活性中心

22/744、催化機(jī)理羧肽酶催化機(jī)制1、促進(jìn)水解離機(jī)制2、Glu-270親和機(jī)制23/7424/7425/745、鋅離子作用1、被裂解肽鍵羰基指向鋅離子，鋅離子起吸電子作用，使C=O鍵比正常更為極化，使羰基C原子更易接收親核進(jìn)攻；2、鋅離子處于非極性環(huán)境促進(jìn)了誘導(dǎo)偶極子產(chǎn)生，增加了它有效電荷；3、Glu270負(fù)電荷迫近也對(duì)羰基上產(chǎn)生一個(gè)大偶極子做出了貢獻(xiàn)。

26/7427/74Chapter.3過(guò)渡頁(yè)

TRANSITIONPAGE酶在大分子切割和拼接方面應(yīng)用——以自我剪切酶和自我剪接酶為例28/74Chp1知識(shí)概述1.3酶在大分子切割和拼接方面應(yīng)用——以自我剪切酶和自我剪接酶為例核酶自我剪切酶自我剪接酶應(yīng)用Part1Part2Part3Part429/74Chapter.1核酶過(guò)渡頁(yè)

TRANSITIONPAGE30/7420世紀(jì)30年代酶定義：酶是一類含有生物催化作用蛋白質(zhì)。31/741982年Cech等發(fā)覺(jué)四膜蟲(chóng)細(xì)胞大核期間26SrRNA前體含有自我剪接功效，并于1986年證實(shí)其內(nèi)含子L-19IVS含有各種催化功效。1984年Altman等發(fā)覺(jué)RNaseP核酸組分M1RNA含有該酶活性，而該酶蛋白質(zhì)部分C5蛋白并無(wú)酶活性。Cech和Altman因發(fā)覺(jué)Ribozyme而取得1989年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。切赫ThomasRobertCech32/74為何RNA有這種功效？凡是含有催化功效分子，大多與其構(gòu)象相關(guān)它會(huì)折疊成一定構(gòu)型，并可辨識(shí)其所要切開(kāi)序列，其反應(yīng)也需要金屬離子幫助，都很像是酶行為。DNA是雙股核酸，而且其分子量非常巨大，所以無(wú)法自由卷繞成特定構(gòu)象，都只是形成長(zhǎng)長(zhǎng)雙螺旋結(jié)構(gòu)。33/74至于RNA分子結(jié)構(gòu)，就其化學(xué)組成上看，也是由四種核苷酸組成多聚體。它與DNA不一樣，首先在于以U代替了T，其次是用核糖代替了脫氧核糖，另外，還有一個(gè)主要不一樣點(diǎn)，就是絕大部分RNA以單鏈形式存在，但能夠折疊起來(lái)形成若干雙鏈區(qū)域。在這些區(qū)域內(nèi)，凡互補(bǔ)堿基對(duì)間能夠形成氫鍵(圖)。但有一些以RNA為遺傳物質(zhì)動(dòng)物病毒含有雙鏈RNA。34/74RNA分子因?yàn)槭菃喂珊怂幔移浞肿油ǔ２粫?huì)很長(zhǎng)，所以能夠卷繞成一定分子構(gòu)象，可能因而含有催化能力；此種含有催化力RNA，統(tǒng)稱之為核酶。核酶是唯一非蛋白酶。它是一類特殊RNA，能夠催化RNA分子中磷酸酯水解及其逆反應(yīng)。35/74

核酶剪切型核酶剪接型核酶依據(jù)催化反應(yīng)錘頭核酶I內(nèi)含子II內(nèi)含子發(fā)夾核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP36/74Chapter.2自我剪切酶過(guò)渡頁(yè)

TRANSITIONPAGE37/74T.R.Cech

1981年，ThomasCech和他同事在研究原生動(dòng)物嗜熱四膜蟲(chóng)26srRNA基因中有一段內(nèi)含子，該基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——前體rRNA中對(duì)應(yīng)于這段內(nèi)含子核苷酸次序是一個(gè)有413個(gè)核苷酸居間序列(IVS)。在前體rRNA加工過(guò)程中去除基因內(nèi)含子時(shí)這個(gè)IVS可自我催化除去,并最終使5’→外顯子與3’→外顯子連接成成熟rRNA分子38/74由此取得一個(gè)驚奇發(fā)覺(jué)∶內(nèi)含子切除反應(yīng)發(fā)生在僅含有核苷酸和純化26SrRNA前體而不含有任何蛋白質(zhì)催化劑溶液中，可能解釋只能是:內(nèi)含子切除是由26SrRNA前體本身催化，而不是蛋白質(zhì)。

結(jié)論：IVS含有類似蛋白酶功效，能夠打斷及重建磷酸二脂鍵。39/74

為了證實(shí)剪接過(guò)程中，確實(shí)沒(méi)有蛋白質(zhì)參加，切赫用重組DNA技術(shù)得到四膜蟲(chóng)rRNA基因中413bP連同兩側(cè)DNA克隆片段，將其離體DNA克隆到細(xì)菌中而且在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄成26SrRNA前體分子，再進(jìn)行SDS-酚抽提，以確保轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物前體rRNA不與酶蛋白結(jié)合，在電泳圖譜上可看到環(huán)狀I(lǐng)VS，線狀I(lǐng)VS和缺失15個(gè)核苷酸線狀物3條譜帶，結(jié)合其它一些試驗(yàn)結(jié)果，能夠充分必定前體rRNA可在非酶蛋白質(zhì)存在條件下進(jìn)行自我剪接。

思索：為何有這么試驗(yàn)結(jié)果？40/74

前體RNA生物剛開(kāi)始轉(zhuǎn)錄出來(lái)RNA是不成熟,能夠稱為前體RNA。對(duì)于原核生物，當(dāng)前體RNA經(jīng)過(guò)加工,

mRNA由RNA聚合酶合成后，將里面內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄部分切掉。這么才能形成有功效mRNA，然后從細(xì)胞核中出來(lái)。Clickme41/74剪切型核酶特點(diǎn)：這類核酶作用是只剪不接，催化本身RNA或不一樣RNA分子，切下特異核苷酸序列。類型：自體催化剪切型：RNA前體異體催化剪切型書(shū)本28342/74剪切機(jī)制轉(zhuǎn)酯化過(guò)程：由靠近位點(diǎn)3‘端2’OH或氧原子對(duì)切割位點(diǎn)磷原子實(shí)施親核攻擊，產(chǎn)生5‘-OH和2’，3‘-環(huán)磷酸二酯。43/74

一、錘頭型核酶a中N,N’代表任意核苷酸；X能夠是A、U或者C,但不能是G；I、II和III是錘頭結(jié)構(gòu)中雙螺旋區(qū)；箭頭指向切割位點(diǎn)。b是錘頭型核酶立體結(jié)構(gòu)模型，白色鏈?zhǔn)呛嗣?，灰色鏈?zhǔn)堑孜颮NA分子，在磷酸骨架上結(jié)合有鎂離子PS:書(shū)本15144/74二、發(fā)夾型核酶50個(gè)堿基核酶和14個(gè)堿基底物形成了發(fā)夾狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，包含4個(gè)螺旋和5個(gè)突環(huán)。螺旋3和4在核酶內(nèi)部形成，螺旋1(6堿基對(duì))和2(4堿基對(duì))由核酶與底物共同形成，實(shí)現(xiàn)了酶與底物結(jié)合。核酶識(shí)別次序是NGUC，其中N代表任何一個(gè)核苷酸，這個(gè)次序位于螺旋1和2之間底物RNA鏈上，切割反應(yīng)發(fā)生在N和G之間。45/74剪接型核酶自我剪接酶是在一定條件下催化本身RNA分子同時(shí)進(jìn)行剪切和連接反應(yīng)R酶。類型：I類內(nèi)含子（IVS）自我剪接Ⅱ類內(nèi)含子自我剪接PS：書(shū)本28546/74

一、I類內(nèi)含子I型IVS是與四膜蟲(chóng)26srRNA前體IVS結(jié)構(gòu)相同間隔序列，含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)磷酸酯反應(yīng)，生成成熟26srRNA及G-IVS.G-IVS經(jīng)兩次環(huán)化生成L-19IVS。催化過(guò)程需要鳥(niǎo)苷酸或鳥(niǎo)苷以及鎂離子參加。剪接機(jī)制47/7448/7449/74ClickmePS：書(shū)本14750/7451/74

二、Ⅱ類內(nèi)含子Ⅱ型IVS是與細(xì)胞核mRNA前體IVS結(jié)構(gòu)相同間隔序列。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)磷酸酯反應(yīng)，生成成熟RNA及套環(huán)狀I(lǐng)VS。催化剪接反應(yīng)不需要鳥(niǎo)苷或鳥(niǎo)苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg2+)。

剪接機(jī)制52/7453/7454/74

類型Ⅰ自我拼接內(nèi)含子分布很廣，存在于真核生物細(xì)胞器基因，低等真核生物核rRNA基因，細(xì)菌和噬菌體個(gè)別基因中。類型Ⅱ內(nèi)含子只見(jiàn)于一些真菌線粒體和植物葉綠體基因。55/74利用核酶進(jìn)行基因工作治療策略包含5個(gè)步驟即:1)選擇適當(dāng)核酶及其載體;2)核酶與載體連接并轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞;3)核酶轉(zhuǎn)錄,在細(xì)胞內(nèi)不停產(chǎn)生大量核酶分子;4)核酶經(jīng)過(guò)共有序列識(shí)別與異?；蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合;5)異常產(chǎn)物被核酶剪切并被RNase降解,核酶循環(huán)利用。1醫(yī)學(xué)應(yīng)用核酶作為基因工程藥品含有兩個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn):1)核酶本質(zhì)是RNA,其引發(fā)免疫應(yīng)答可能性比外源蛋白小得多;2)普通核酶分子比較小,易于操作。56/74基因突變有時(shí)會(huì)在內(nèi)含子中生成新剪接點(diǎn)，當(dāng)然也是異常剪接點(diǎn)。它們與左鄰右舍原來(lái)不起作用隱匿剪接點(diǎn)搭配起來(lái)，就會(huì)形成錯(cuò)誤剪接。因?yàn)樵姓＜艚狱c(diǎn)并未喪失功效，只是作用被異常剪接抑制，所以用反義核酸經(jīng)過(guò)堿基互補(bǔ)，封閉異常剪接點(diǎn)或其它剪接元件，就可堵住異常剪接路徑，迫使剪接系統(tǒng)選擇正確路徑，形成正常RNA。這就間接地對(duì)RNA缺點(diǎn)作了“修復(fù)”。恢復(fù)正常剪接路徑57/74防治動(dòng)、植物病毒侵害：構(gòu)建錘頭型核酶對(duì)煙草花葉病毒(TMV)RNA片段進(jìn)行體外剪切,馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒負(fù)鏈多價(jià)核酶構(gòu)建，馬鈴薯卷葉病毒復(fù)制酶基因負(fù)鏈突變核酶克隆等。2植物病毒防治應(yīng)用58/74Chapter.4氫化酶在生物制氫中應(yīng)用過(guò)渡頁(yè)

TRANSITIONPAGE59/744.1氫化酶是什么？1931年科學(xué)家將微生物體內(nèi)能夠分解甲酸產(chǎn)生氫氣物質(zhì)稱為氫化酶，廣泛存在于原核生物及低等真核生物體內(nèi)。氫化酶（英語(yǔ)；Hydrogenase）也稱氫酶，是一個(gè)能夠可逆地催化氫氣氧化還原酶，以下方程式：

（1）H2

+Aox

→2H+

+Ared（2）2H++Dred

→H2

+Dox60/744.1

氫化酶分類氫化酶分類。鎳鐵類雙鐵類單鐵類雙鐵類氫化酶產(chǎn)氫活性最高，是其它二者10~100倍，{NIFE）類氫化酶在自然界中含量最豐富，人們對(duì)其研究最廣泛最深入。61/74氫化酶產(chǎn)生菌氫化酶產(chǎn)生菌綠藻渾球紅細(xì)菌巴氏桿菌脫硫弧菌62/74氫化酶應(yīng)用1自從1939年Gaffron發(fā)覺(jué)綠藻含有產(chǎn)氫功效以來(lái)，生物制氫技術(shù)逐步受到植物界、微生物界、能源界以及相關(guān)專業(yè)研究人員廣泛關(guān)注，人們?cè)诎l(fā)酵原料、發(fā)酵條件、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)氫機(jī)制等方面做了大量研究。生物制氫以其原料起源豐富、價(jià)格低廉、低能耗、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，是當(dāng)前研究最快，并有望進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)一個(gè)制氫方法。生物制氫63/74氫化酶應(yīng)用2生物制氫依據(jù)所選取微生物、產(chǎn)氫底物及其產(chǎn)氫機(jī)理，生物制氫能夠分為藍(lán)細(xì)菌和綠藻制氫、光合細(xì)菌制氫和厭氧發(fā)酵制氫等3種類型。其中厭氧發(fā)酵制氫采取是產(chǎn)氫菌厭氧發(fā)酵，它優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)氫速度快，反應(yīng)器設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，且能夠利用可再生資源和廢棄有機(jī)物進(jìn)行生產(chǎn)，相對(duì)于其它兩種方法更輕易在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)。64/74綠藻制氫厭氧發(fā)酵制氫And厭氧細(xì)菌在黑暗、厭氧條件下分解有機(jī)物產(chǎn)生氫氣，通常稱為厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫或黑暗（暗）發(fā)酵產(chǎn)氫。當(dāng)前，綠藻產(chǎn)氫代謝路徑主要能夠分為直接生物光解路徑和間接生物光解路徑。氫化酶應(yīng)用65/744.3生物制氫厭氧發(fā)酵制氫厭氧發(fā)酵底物利用范圍很廣泛(包含垃圾、廢品),能更有效地制氫。另外,發(fā)酵制氫通常有較高收益率且不依賴光源碳水化合物主要是葡萄糖，是發(fā)酵過(guò)程首選碳源,主要產(chǎn)生乙酸、丁酸與氫氣,詳細(xì)反應(yīng)如式(1)、式(2)。C6H12O6+2H2O—2CH3COOH+2CO2+4H2

（1）C6H12O6+2H2O—CH3CH2COOH

+

2CO2

+

2H2

（2）66/74產(chǎn)氫細(xì)菌直接產(chǎn)氫過(guò)程均發(fā)生于丙酮酸脫羧作用中，其中兩方式。一為梭狀芽孢桿菌型。二是腸道桿菌型該過(guò)程中丙酮酸脫羧后形成甲酸，然后甲酸全部或部分裂解轉(zhuǎn)化為

H2

和

CO2。厭氧發(fā)酵制氫67/74依據(jù)氫酶催化特征，氫酶能夠分為吸氫酶、放氫酶和雙向氫酶三

類。放氫酶主要表現(xiàn)為催化產(chǎn)氫反應(yīng)吸氫酶主要表現(xiàn)催化吸氫反應(yīng)雙向氫酶表現(xiàn)出催化性質(zhì)則依氫酶所處環(huán)境而定，既能催化吸氫反應(yīng)又能催化放氫反應(yīng)。當(dāng)前已經(jīng)有許多學(xué)者經(jīng)過(guò)基因改造氫酶來(lái)提升生物制氫產(chǎn)量。68/74在直接生物光解路徑中，綠藻經(jīng)過(guò)捕捉太陽(yáng)光，利用光能經(jīng)由光合反應(yīng)將水分子光解，取得低電位還原力，并最終還原Fe氫化酶釋放出氫氣（圖1）綠藻制氫69/74間接生物光解路徑能夠分為兩個(gè)階段，在第一個(gè)階段中，綠藻細(xì)胞在有氧條件下經(jīng)過(guò)光合作用固定二氧化碳，合成細(xì)胞物質(zhì)。而在第二個(gè)階段中，在無(wú)氧條件下，這些細(xì)胞物質(zhì)會(huì)經(jīng)過(guò)酵解產(chǎn)生還原力，用于Fe氫化酶還原和氫氣釋放（圖2）綠藻制氫70/74世界首例生物制氫生產(chǎn)線在我國(guó)開(kāi)啟71/74[1]黃國(guó)榮,朱俊東,糜漫天,郎海濱.啤酒酵母多糖提取工藝研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).(06).[2]張玉香,尹卓容.甘露糖蛋白提純及分子量測(cè)定[J].釀酒科技.(04)[3]劉景圣,蔡丹,孫濤.嗜酸乳桿菌細(xì)胞壁肽聚糖分離提取[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).(04).[4]溫曉慶,托婭,段智變,張和平.Lb.casei.Zhang肽聚糖體內(nèi)外抗腫瘤作用[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).(03).[5]李剛,徐芳杰,蔣思絲,章永松,林咸永.鋁對(duì)小麥根尖細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶活性和過(guò)氧化氫含量影響[J].植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào).(04).[6]吳靜,閔柔,鄔敏辰等.羧肽酶研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)報(bào).,31(8):793-799[7]孫楊,陳穎潔.肥大細(xì)胞羧肽酶A研究進(jìn)展[J].科技信息.:500-501.[8]高彥飛,王飛霞.蛋白質(zhì)及多肽C端測(cè)序研究進(jìn)展[J].分析化學(xué).,35(12):1820-1826.參考文件72/74[9]王鏡巖，朱圣庚等.生物化學(xué)第三版下冊(cè)[J]