藥品微生物檢驗基礎知識

藥品微生物檢驗基礎知識一、微生物基本介紹1、微生物的定義微生物是一些形體微小，以單細胞或簡單多細胞、甚至是沒有細胞結構的形式存在的低等生物的統稱。2、微生物的分類微生物的主要分類單位：域、界、門、綱、目、科、屬、種、變種、亞種（小種）、型、菌株（品系）“種”是最本的分類單位，例：大腸埃希菌第2頁,共57頁，2024年2月25日，星期天一、微生物基本介紹3、微生物的特點體形微??；結構簡單；生長繁殖快；種類繁多，分布廣，適應性強。包括：細菌、酵母菌、霉菌、放線菌、立克次氏體、支原體和病毒等。第3頁,共57頁，2024年2月25日，星期天一、微生物基本介紹4.1細菌藥典收錄的有代表性的常見細菌有1大腸埃希菌2金黃色葡萄球菌3枯草芽孢桿菌4生孢梭菌5銅綠假單胞菌第4頁,共57頁，2024年2月25日，星期天1大腸埃希菌

大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）通常被稱為大腸桿菌，是Escherich在1885年發(fā)現的，在相當長的一段時間內一直被當作正常腸道菌群的組成部分認為是非致病菌。一般多不致病，為人和動物腸道中的常居菌，在一定條件下可引起腸道外感染。某些血清型菌株的致病性強，引起腹瀉，統稱致病性大腸桿菌。人體感染致病EHEC后，會發(fā)生嚴重的痙攣性腹痛和反復發(fā)作的出血性腹瀉，同時伴有發(fā)熱、嘔吐等表現，多為EHEC產生的毒素所致。第5頁,共57頁，2024年2月25日，星期天2金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬有“嗜肉菌"的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染。第6頁,共57頁，2024年2月25日，星期天2金黃色葡萄球菌典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。第7頁,共57頁，2024年2月25日，星期天3枯草芽孢桿菌

枯草芽胞桿菌，是芽胞桿菌屬的一種。單個細胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌。第8頁,共57頁，2024年2月25日，星期天4生孢梭菌

生孢梭菌（Clostridium

sporogenes）又譯產孢梭菌，能夠產生孢子，革蘭氏染色陽性，以周生鞭運動，嚴格厭氧的梭菌。第9頁,共57頁，2024年2月25日，星期天5銅綠假單胞菌

銅綠假單胞菌的學名是Pseudomonasaeruginosa，綠膿假單胞菌屬為革蘭染色陰性需氧菌，存在于土壤、塵埃、水和少數人體腸道中，亦可暫時寄生于皮膚，主要寄生在肛門、生殖器部位、腋窩和外耳道等處。在正常情況下一般不致病，當機體抵抗力低下時可致病，還可引起病人死亡。第10頁,共57頁，2024年2月25日，星期天細菌鑒別革蘭氏染色格蘭仕陽性菌例如：金黃色葡萄球菌，也稱“金葡菌”，細胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。其肽聚糖的網狀結構比革蘭氏陰性菌致密，染色時結晶紫附著后不被酒精脫色故而呈現紫色革蘭氏陰性菌例如:大腸埃希菌的細胞壁肽聚糖層薄、交聯度差，脂類含量高，所以紫色復合物被酒精沖掉然后附著了沙黃的紅色。第11頁,共57頁，2024年2月25日，星期天革蘭氏染色革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：1）涂片固定。2）草酸銨結晶紫染1分鐘。3）自來水沖洗。4）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。5）水洗，用吸水紙吸去水分。6）加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，20秒后水洗，吸去水分。7）蕃紅染色液（稀）染1分鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。第12頁,共57頁，2024年2月25日，星期天染色結果

革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

第13頁,共57頁，2024年2月25日，星期天染色結果

革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色第14頁,共57頁，2024年2月25日，星期天一、微生物基本介紹4.2真菌（包括酵母菌和霉菌）1黑曲霉菌2白色念珠菌第15頁,共57頁，2024年2月25日，星期天1黑曲霉菌

黑曲霉，半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬真菌中的一個常見種。廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產品和土壤中。第16頁,共57頁，2024年2月25日，星期天2白色念珠菌

白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂白色念珠菌白色念珠菌（Moniliaalbican或canidiaAlbicans），是一種真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道，是醫(yī)學全身性真菌感染病的重要途徑，可以引起心膜炎、肺炎、尿布疹、鵝口瘡、陰道炎、腦膜炎、及敗血癥。第17頁,共57頁，2024年2月25日，星期天白色念珠菌右圖：白色念珠菌在該批念珠菌顯色對照培養(yǎng)基表面培養(yǎng)48小時的生長形態(tài)。左圖：白色念珠菌在該批念珠菌顯色對照培養(yǎng)基表面培養(yǎng)24小時的生長形態(tài)；第18頁,共57頁，2024年2月25日，星期天一、微生物基本介紹5、微生物與我們每張人民幣帶細菌：900萬個；人體體表及體內存在大量的微生物；皮膚表面：平均10萬個細菌/平方厘米；口腔“細菌種類超過500種；腸道：微生物總量達100萬億；第19頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

（未清洗的手）

（清洗過的手）

一、微生物基本介紹第20頁,共57頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的配制：

按處方配制，使用按處方生產的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基第21頁,共57頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基配制時注意：不得使用結塊或顏色發(fā)生改變的脫水培養(yǎng)基；常用的溶劑是純化水、蒸餾水，避免使用自來水，因其中含有氯等抗菌物質；脫水型培養(yǎng)基應完全溶解于水中，再分裝滅菌；加熱助溶，注意不要過度加熱；如需要添加其它組分，加入后應充分混勻；配制用的容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器；配制培養(yǎng)基一般要在1小時內完成，如果室溫高，配制時間過長，易使培養(yǎng)基受污染；第22頁,共57頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基的滅菌已配制好的培養(yǎng)基最好盡快滅菌；一般培養(yǎng)基采用濕熱滅菌，即高壓蒸汽菌，通常是121℃15分鐘；濕熱滅菌必須嚴格控制滅菌溫度和時間，不可重復高溫滅菌；高壓蒸汽滅菌鍋在使用時，內置物品不能太多，不要堆積形成死角。要定期對壓力表等進行檢定，檢定周期一般為半年；定期對滅菌效果進行檢驗，可采用生物指示菌法、化學變色紙片（如濕熱滅菌指示條）等進行驗證。第23頁,共57頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基3、培養(yǎng)基的貯藏貯藏注意：滅菌后的培養(yǎng)基應迅速取出，避免長時間保存在滅菌鍋內，造成過度滅菌；培養(yǎng)基保存前應標上名稱和制備日期（或到期日期）；瓊脂培養(yǎng)基不得在0℃或0℃以下存放；瓊脂平板最好現配現用，如置冰箱保存，在驗證的期限內使用；藥典規(guī)定3周內使用，有密封裝置的培養(yǎng)基可以保存一年第24頁,共57頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基4、培養(yǎng)的再融化方式水浴加熱微波爐電熱爐加熱注意：固體培養(yǎng)基滅菌后的再融化只允許一次融化的培養(yǎng)基應置于45℃～50℃的水浴中，不得超過8小時第25頁,共57頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基5、培養(yǎng)基的性能評估所有購回的、配制好的培養(yǎng)基均應進行質量控制試驗（培養(yǎng)基適應性檢查）理化指標（P55）微生物學指標（P55）第26頁,共57頁，2024年2月25日，星期天購買的成品培養(yǎng)基配方與藥典配方核對第27頁,共57頁，2024年2月25日，星期天中檢院購買的對照培養(yǎng)基第28頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、菌種1、分類（概念）：標

準

菌

株由國內或國際菌種保藏機構保藏的標準儲備菌株由標準菌株經一次傳代得到的培養(yǎng)物商業(yè)派生菌株由供應商提供的所有特性與標準菌株等效的菌株工

作

菌

株由標準儲備菌株以傳代得到的培養(yǎng)物第29頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、菌種注意：標準儲備菌株、工作菌株都應進行純度和特性確認工作菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種收藏機構獲得的標準菌株為第0代）“1代”是指將活的培養(yǎng)物接種到微生物生長的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實驗室必須建立和保存其所有菌種的進出、收集、貯藏、保存、確認試驗及銷毀的記錄。第30頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、菌種標準菌株：①凍干粉（圖P63）②甘油凍存管（圖P64）第31頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、菌種菌種保藏機構：CMCC中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心GIMCC廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心ATCC美國典型菌種保藏中心例：

CMCC

（B）

26003菌種保藏機構

細菌

菌種編號（金黃葡萄球菌）第32頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、菌種2、菌種的鑒定

金黃色葡萄菌CMCC(B)26003甘露醇平板上劃線分純，典型菌落

為黃色圓形突起，表面濕潤光滑；革蘭氏染色：陽性，球菌。血漿凝固霉酶實驗：陽性第33頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、菌種2、菌種的鑒定大腸埃希菌CMCC(B)44102大腸埃希菌在麥康凱培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征：鮮桃紅色或微紅色,菌落中心呈深桃紅色,圓形,扁平,邊緣整齊,表面光滑,濕潤革蘭氏染色：陰性，桿菌。第34頁,共57頁，2024年2月25日，星期天大腸埃希菌(Escherichiacoli)供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”（通則1105）制成1：10供試液。取相當于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。第35頁,共57頁，2024年2月25日，星期天大腸埃希菌(Escherichiacoli)

選擇和分離培養(yǎng)

取上述預培養(yǎng)物1mL接種至100mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。第36頁,共57頁，2024年2月25日，星期天大腸埃希菌(Escherichiacoli)結果判斷

若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗,確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。第37頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、菌種銅綠假單胞菌CMCC(B)10104溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上劃線分純，典型菌落呈扁平，無定形、周邊擴散，表面濕——灰白色，周圍有藍綠色素擴散。氧化酶實驗：陽性綠膿菌素：陽性革蘭氏染色：陰性，桿菌；第38頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、菌種白色念珠菌CMCC(B)98001沙氏葡萄糖瓊脂平板上劃線分純，典型菌落乳白色，表面光滑有濃酵母氣味。革蘭氏染色：陽性，菌體大，球菌。芽管試驗：陽性第39頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、菌種3、菌種的保藏A：甘油冷凍管保藏法保藏溫度：－30℃～80℃；保藏菌種有效期：1～2年優(yōu)點：保存期較長，反復傳代導致菌種變異的風險較?。蝗秉c：操作相對復雜，成本較高。B：斜面低溫保藏法保藏溫度4℃左右，保藏時間1～3個月，但銅綠假單胞菌不宜用本法保存。優(yōu)點：操作簡便，成本低，比較容易掌握；缺點：保存期比較短，反復傳代有引起變異的可能。。

保藏溫度保藏有效期優(yōu)點缺點甘油冷凍管保藏法-30℃～80℃1～2年·保存期較長，·反復傳代導致菌種變異的風險較小·操作相對復雜，·成本較高斜面低溫保藏法4℃左右1～3個月·操作簡便，·成本低，·比較容易掌握·保存期比較短，·反復傳代有引起變異的可能；·銅綠假單胞菌不宜用本法保存。第40頁,共57頁，2024年2月25日，星期天甘油冷凍管保存菌種第41頁,共57頁，2024年2月25日，星期天甘油冷凍管保存菌種第42頁,共57頁，2024年2月25日，星期天甘油冷凍柜保存菌種第43頁,共57頁，2024年2月25日，星期天三、菌種4、菌種的使用和銷毀過期菌種應及時銷毀，銷毀時應經121℃30分鐘的生物滅活處理。121℃45min高溫蒸汽滅活。并進行菌種銷毀記錄。第44頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四、微生物限度檢查法1、定義微生物限度檢查法—系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。2、檢查項目定量檢查—細菌數、霉菌及酵母菌數定性檢查—控制菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌）檢驗環(huán)境：與無菌檢查相同第45頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四、微生物限度檢查法3、檢驗量指一次檢驗用量；10g或10ml，膜劑為100cm2，貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。4、供試液的制備根據供試品的理化特性與生物特性，采取適宜的方法制備供試液；供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不超過45℃。第46頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四、微生物限度檢查法制備原則：簡便、快速！供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。第47頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四、微生物限度檢查法供試品分類液體供試品固體、半固體或黏稠性供試品需用特殊供試液制備方法的供試品非水溶性供試品膜劑供試品腸溶及結腸制劑供試品氣霧劑、噴霧劑供試品貼膏劑供試品具抑菌活性的供試品：培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法

第48頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四、微生物限度檢查法5、方法驗證5.1驗證菌株大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉5.2計數方法的驗證當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產品的細菌、霉菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。第49頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四、微生物限度檢查法⑴試驗組薄膜過濾法計數時：取規(guī)定量的供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。⑵菌液組測定所加的試驗菌數（50～100cfu）⑶供試品對照組取規(guī)定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數⑷稀釋對照組用相應的稀釋液替代供試品，加入50～100cfu試驗菌，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。第50頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四、微生物限度檢查法驗證方法：驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算試驗菌每次試驗的回收率不低于70%，若任一次試驗中試驗組的菌回收低于70%，應采取適宜的方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行進行方法驗證。第51頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四、微生物限度檢查法5.3控制菌檢查法驗證當建立藥品的微生物限度檢查法時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查。采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌（10～100cfu）應加在最后一次沖洗液中，依法操作。若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應采用相應方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。第52頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四、微生物限度檢查法5.4細菌、霉菌及酵母菌檢查檢查方法：平皿法和薄膜過濾法按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數檢查第53頁,共57頁，2024年2月25日，星期天四、微生物限度檢查法菌落報告規(guī)則：細菌、酵母