【生物】基因工程的基本操作程序課件-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第3章

第2節(jié)、基因工程的基本操作程序（含DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定）基因表達(dá)載體本節(jié)聚焦:1.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？2.基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？從社會(huì)中來(lái)課本P76、76轉(zhuǎn)基因抗蟲棉非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(P76)①Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理？②抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會(huì)不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？P77[相關(guān)信息]你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？

當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生上述影響蘇云金桿菌與載體拼接普通棉花（無(wú)抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取導(dǎo)入抗蟲基因（Bt抗蟲蛋白基因）重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡(jiǎn)要過(guò)程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測(cè)與鑒定實(shí)例：具體的步驟是？(含抗蟲基因）（含有并表達(dá)抗蟲基因）1、目的基因的篩選與獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定核心有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。基因工程的基本操作程序01第一步：目的基因的篩選與獲取獲取目的基因時(shí)獲取的是哪一部分的DNA片段？在解決這個(gè)問(wèn)題之前，我們得先了解基因的結(jié)構(gòu)是怎樣的？1.目的基因(1)概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于

或

等的基因。(3)實(shí)例：與

等相關(guān)的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要指的是

。改變受體細(xì)胞性狀獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物(2)作用：編碼蛋白質(zhì)的基因生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶資料：蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因--Bt抗蟲蛋白基因1一、目的基因的篩選與獲取

一第一步：目的基因的篩選與獲取注意：

所有的基因都編碼蛋白質(zhì)或肽鏈?；虻姆N類一般分為結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄基因和調(diào)控基因。結(jié)構(gòu)基因的功能：具有轉(zhuǎn)錄和翻譯功能，能控制生物性狀（編碼蛋白質(zhì)或肽鏈）。轉(zhuǎn)錄基因的功能：只有轉(zhuǎn)錄功能，沒有翻譯功能，能轉(zhuǎn)錄形成tRNA和rRNA。調(diào)控基因的功能：不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，只能調(diào)控其他基因的表達(dá)。知識(shí)拓展：基因不是基因1基因2基因3知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)DNA片段放大基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段；能編碼特定的蛋白質(zhì)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段啟動(dòng)子1.編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)的序列。2.非編碼區(qū)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列。不轉(zhuǎn)錄，不編碼蛋白質(zhì)；知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)終止子獲取目的基因一般獲取哪一部分的DNA片段？基因編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA啟動(dòng)子終止子本質(zhì)：位置：作用：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；位于基因上游；也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；位于基因下游；終止轉(zhuǎn)錄本質(zhì)：位置：作用：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子外顯子：內(nèi)含子：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，然后在翻譯前就被剪切掉。知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄剪接外顯子內(nèi)含子前體mRNA成熟mRNA真核生物基因的表達(dá)知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄形成的mRNA需要在細(xì)胞核加工處理成為成熟的mRNA后才能作為下一步翻譯的模板。CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---某原核細(xì)胞基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)不編碼mRNA不編碼mRNA(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子RNA聚合酶原核生物基因的表達(dá)過(guò)程知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄mRNA某原核細(xì)胞基因原核生物基因的表達(dá)過(guò)程知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)某原核細(xì)胞基因原核生物基因的表達(dá)過(guò)程知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---某真核細(xì)胞基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)不編碼mRNA不編碼mRNA(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子RNA聚合酶外顯子內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子真核生物基因的表達(dá)過(guò)程知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄初始mRNA某真核細(xì)胞基因外顯子內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子真核生物基因的表達(dá)過(guò)程知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄某真核細(xì)胞基因外顯子內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子RNA加工CA……UAGGAUCCAGAUG翻譯蛋白質(zhì)初始mRNA成熟mRNA真核生物基因的表達(dá)過(guò)程知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)【總結(jié)】原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較不能編碼蛋白質(zhì)的序列=

非編碼區(qū)原核生物的基因：不能編碼蛋白質(zhì)的序列真核生物的基因：=非編碼區(qū)+內(nèi)含子原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的

和具有調(diào)控作用的

區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)目的基因的篩選和獲取的方法是怎樣的？2.篩選合適的目的基因1一、目的基因的篩選與獲取1.較為有效的方法之一從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。2.認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank）、序列比對(duì)工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來(lái)越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能。3.實(shí)例：Bt

抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過(guò)程用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害也對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)不僅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因13.目的基因的獲取方法1一、目的基因的篩選與獲取?獲取目的基因的方法：①利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因②從基因文庫(kù)中獲?、廴斯ず铣汕疤幔悍椒ǎ篋NA合成儀基因比較小、核苷酸序列已知通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成（常用）重點(diǎn)了解什么是PCR？人工合成目的基因1.化學(xué)方法人工合成：(1)需要儀器：DNA合成儀。(2)適用目的基因類型：基因比較小，核苷酸序列又已知。(3)不需要模板。DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成比如：引物2.反轉(zhuǎn)錄法：基因的相對(duì)分子質(zhì)量大而又不知其序列。目的基因的mRNA雜交雙鏈(RNA-DNA)單鏈DNA雙鏈DNA(目的基因)逆轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因1.基因文庫(kù)概念：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。2.基因文庫(kù)類型：基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因。部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系？構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因3.基因文庫(kù)的構(gòu)建：將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存(1)基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA多個(gè)一定大小的DNA片段基因表達(dá)載體用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈罨蚪M文庫(kù)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因3.基因文庫(kù)的構(gòu)建：(2)部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)）構(gòu)建提取某種生物某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈DNA片段基因表達(dá)載體與載體連接cDNA文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HRNA-DNA雜交雙鏈單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較PCR是

的縮寫。它是一項(xiàng)根據(jù)＿＿＿＿＿的原理，在

提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)

的技術(shù)。利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因1.PCR的概念：中文全稱原理操作環(huán)境目的PCR擴(kuò)增儀聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。離心管CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋目的基因的篩選與獲取回顧：體內(nèi)DNA復(fù)制CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT（2）合成子鏈回顧：體內(nèi)DNA復(fù)制CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATPDNA聚合酶作用下形成磷酸二酯鍵子鏈延伸合成的方向？只能從5′－端→3′－端延伸，細(xì)胞內(nèi)有RNA引物結(jié)合到模板3′－端引發(fā)子鏈的延伸回顧：體內(nèi)DNA復(fù)制（2）合成子鏈CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'（3）重新螺旋形成新的DNA分子回顧：體內(nèi)DNA復(fù)制引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2引物可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈，細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制通常以RNA單鏈為引物細(xì)胞外（PCR）一般以DNA單鏈為引物用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20~30個(gè)核苷酸。引物結(jié)合在模板鏈的3’端因?yàn)镈NA聚合酶不能直接將單個(gè)的核苷酸聚合成鏈。子鏈合成需要引物？利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因2.DNA體外復(fù)制（PCR）的條件：體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分在DNA復(fù)制中的作用PCR中參與的組分解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物無(wú)需解旋酶，用高溫(90℃以上)代替DNA模板(含目的基因的DNA片段)4種脫氧核苷酸(dNTP)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（變性）提供相對(duì)穩(wěn)定的pH環(huán)境；一般添加Mg2+，真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。dNTP和ATP類似,不但可以提供原料還可以提供能量，無(wú)需添加ATP。耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）2種引物(常為小的單鏈DNA，通常為20-30個(gè)核苷酸)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3.PCR的過(guò)程：當(dāng)溫度超過(guò)_____以上時(shí)，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA待擴(kuò)增的DNA片段(1)變性：變性90℃變性復(fù)性延伸

3’3’5’5’3’5’3’5’不需要解旋酶思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個(gè)溫度范圍，而不是95℃？因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時(shí)，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時(shí)，所需溫度也就越低。利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3.PCR的過(guò)程：當(dāng)溫度下降

到左右時(shí)，

種引物通過(guò)

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

3’5’3’5’堿基互補(bǔ)配對(duì)引物15’3’引物25’3’(2)復(fù)性：50℃兩由于DNA雙鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模孕枰獌煞N引物變性復(fù)性延伸

思考：為什么需要引物？引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因?yàn)門aq酶不能從0開始添加核苷酸。②引物結(jié)合在DNA模板鏈

3'端位置，引導(dǎo)子鏈從5'端→3'端方向復(fù)制。當(dāng)溫度上升到____左右時(shí)，溶液中的4種_________在耐高溫的_______________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。

脫氧核苷酸DNA聚合酶72℃利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3.PCR的過(guò)程：(3)延伸：(Taq酶)3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’Taq酶3’Taq酶3’變性復(fù)性延伸

思考1：為什么溫度要上升至72℃？思考2：Taq酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？72℃是Taq酶的最適溫度Taq酶結(jié)合在引物的3’端第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪循環(huán)的產(chǎn)物利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因由于一個(gè)循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式擴(kuò)增（約為

，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。指數(shù)2n常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物。4.PCR的結(jié)果：5.PCR產(chǎn)物的鑒定：循環(huán)n次，理論上可獲得DNA數(shù)

，

其中含引物的DNA數(shù)

，含引物的DNA鏈數(shù)

，共需引物數(shù)

。2n2n2n+1-22n+1-2利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因下圖表示PCR的前三個(gè)循環(huán)，目的基因位于模板DNA分子中與兩種引物所對(duì)應(yīng)的位置之間，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題：(1)PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？

不是，PCR擴(kuò)增的僅僅是兩種引物之間所對(duì)應(yīng)的特定DNA片段。(2)如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴(kuò)增出該目的基因的關(guān)鍵是什么？

根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段(即出現(xiàn)完整的目的基因)？5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’一、目的基因的篩選與獲取——利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因練習(xí)：圖1、圖2分別是PCR擴(kuò)增技術(shù)相關(guān)過(guò)程，請(qǐng)思考回答下列問(wèn)題：（1）圖1所示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第

輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。（2）圖2是某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）都不合理，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。第1組：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生

而失效。第2組：引物Ⅰ′

后會(huì)出現(xiàn)局部

而失效。3堿基互補(bǔ)配對(duì)自身折疊堿基互補(bǔ)配對(duì)每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)一、目的基因的篩選與獲取——利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。1.逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA思考：能不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，為什么？如果不能，如何避免該結(jié)果的發(fā)生呢？

①游離的DNA進(jìn)入細(xì)胞后，一般會(huì)直接被分解。

②就算沒有被破壞且能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，游離的DNA也無(wú)法跟著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。核心工作——基因表達(dá)載體構(gòu)建02第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。目的基因＋啟動(dòng)子＋終止子＋標(biāo)記基因+復(fù)制原點(diǎn)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）1.基因表達(dá)載體的目的2.基因表達(dá)載體的組成思考：要各個(gè)元件有什么作用？（1）啟動(dòng)子：①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的

片段。DNA②功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。表達(dá)載體啟動(dòng)子目的基因終止子復(fù)制原點(diǎn)（2）終止子：①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的

片段。②功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)。DNA2.基因表達(dá)載體的組成二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)位置功能啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子的比較DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰的堿基mRNA上三個(gè)相鄰的堿基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)翻譯的起始信號(hào)（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號(hào)（不編碼氨基酸）（3）標(biāo)記基因：①作用：便于重組DNA分子的篩選。②常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，能控制表達(dá)所需要的特殊性狀，如Bt基因。（5）復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)。注意：目的基因必須插入到

與

之間。啟動(dòng)子

終止子（4）目的基因：二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程③再利用

將含目的基因的DNA片段拼接到

的切口處，這樣就形成了一個(gè)重組DNA分子（基因表達(dá)載體）。目的基因限制酶切割位點(diǎn)標(biāo)記基因啟動(dòng)子限制酶切割位點(diǎn)終止子復(fù)制原點(diǎn)限制酶限制酶DNA連接酶①首先用一定的

切割載體（質(zhì)粒），使它出現(xiàn)一個(gè)切口。②然后用

限制酶或能產(chǎn)生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。限制酶同種相同DNA連接酶載體思考·討論使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割（單酶切），是否只會(huì)得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和質(zhì)粒切割（雙酶切），防止目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。將目的基因與載體結(jié)合，構(gòu)建好基因表達(dá)載體后，下面該進(jìn)行什么操作？基因工程第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞思考03第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)（常用）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞②在植物授粉后一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過(guò)花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法導(dǎo)入外源DNA（1）花粉管通道法（我國(guó)獨(dú)創(chuàng)）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞受體細(xì)胞：受精卵（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞體細(xì)胞或受精卵該方法受體細(xì)胞為

?！稗D(zhuǎn)化”概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程，實(shí)質(zhì)是基因重組。①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力；b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功表現(xiàn)出新性狀的植株植物組織培養(yǎng)第一次導(dǎo)入第二次導(dǎo)入第一次拼接第二次拼接將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上。(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌。Ti質(zhì)粒T—DNA目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞過(guò)程：（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關(guān)系？T-DNA不是目的基因，但它將來(lái)會(huì)被整合到宿主細(xì)胞染色體的DNA上，只要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞并整合到宿主細(xì)胞的染色體上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因只能進(jìn)入植物的一個(gè)體細(xì)胞，但基因工程最終要的是一個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，如何實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)？得到含有目的基因的植物細(xì)胞后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)問(wèn)題探討核心探討

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞下面為利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法制備轉(zhuǎn)基因植物的過(guò)程圖，據(jù)圖回答下列問(wèn)題：1.重組Ti質(zhì)粒的構(gòu)建需要哪些酶的作用？限制酶、DNA連接酶。2.將基因表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞時(shí)，應(yīng)怎樣處理農(nóng)桿菌細(xì)胞？要用Ca2＋處理農(nóng)桿菌細(xì)胞，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）導(dǎo)入方法：（2）受體細(xì)胞:顯微注射法受精卵原因：①體積大，易操作；

②易表現(xiàn)出全能性。（3）過(guò)程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物科學(xué)家用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動(dòng)物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)，如腺病毒載體等。病毒侵染法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞(1)常用方法：(2)受體細(xì)胞：Ca2+處理法常選擇原核細(xì)胞（其中以大腸桿菌應(yīng)用最為廣泛）目的：可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)優(yōu)點(diǎn)：繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，易于培養(yǎng)(3)過(guò)程：大腸桿菌使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境DNA分子的生理狀態(tài)溶于緩沖液中的重組DNA分子轉(zhuǎn)化CaCl2(Ca2+)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞(4)應(yīng)用實(shí)例利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物

原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性（原核細(xì)胞中沒有高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等），需要在體外進(jìn)行再加工。轉(zhuǎn)錄翻譯加工如果把一個(gè)真核生物的基因?qū)朐思?xì)胞中表達(dá)，一定會(huì)產(chǎn)生原來(lái)的蛋白質(zhì)嗎？一般不能產(chǎn)生原來(lái)的蛋白質(zhì)原因：①原核生物細(xì)胞里沒有相應(yīng)的機(jī)制來(lái)去除內(nèi)含子；②原核生物沒有真核的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）相應(yīng)機(jī)制剪切內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄出來(lái)的序列真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）前體mRNA成熟mRNA多肽鏈蛋白質(zhì)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法總結(jié)細(xì)胞種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射Ca2＋處理法(CaCl2)受體細(xì)胞受精卵或體細(xì)胞受精卵常用原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中→表達(dá)目的基因表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2+處理細(xì)胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細(xì)胞→重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中將基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞后，如何判斷導(dǎo)入是否成功？即使導(dǎo)入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達(dá)？思考不一定！檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。04第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1.檢測(cè)與鑒定的方法檢測(cè)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。目的：(1)分子水平的檢測(cè)：(2)個(gè)體生物學(xué)水平鑒定：③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA①檢測(cè)目的基因是否插入受體細(xì)胞染色體DNA

上類型檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平的檢測(cè)PCR等技術(shù)抗原-抗體雜交技術(shù)PCR等技術(shù)①檢測(cè)受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)等1.分子水平的檢測(cè)2.個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定類型檢測(cè)內(nèi)容方法個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀或產(chǎn)物是否具有功能活性抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品功能活性比較五、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定材料用具①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）PCR儀電泳裝置⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）微量離心管推動(dòng)桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭（注意：加不同樣品時(shí)，需要更換槍頭）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理：探究·實(shí)踐一、實(shí)驗(yàn)原理(1)PCR利用了

原理，通過(guò)調(diào)節(jié)

來(lái)控制DNA雙鏈的

，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。(2)PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了

的原理。一次PCR一般要經(jīng)歷

次循環(huán)。DNA的熱變性溫度解聚與結(jié)合DNA半保留復(fù)制305’--3’3’--5’3’--5’5’--3’5’--3’-5’5’-3’--5’5’--3’-5’5’-3’--5’3’--3’高溫變性延伸復(fù)性低溫中溫1次循環(huán)DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定探究·實(shí)踐二、材料用具2.試劑:(1)4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無(wú)菌水。10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μLPCR反應(yīng)體系的配方為保證加入反應(yīng)體系中的各試劑體積的準(zhǔn)確性，建議按照加入體積的大小，由大到小依次加入各試劑，即先加入無(wú)菌水。為保護(hù)酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定探究·實(shí)踐三、實(shí)驗(yàn)步驟(1)DNA片段的擴(kuò)增①移液：用微量移液器依次將各組分加入微量離心管中。（注意：酶和緩沖液要在冰塊上緩慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和緩沖液一般分裝成小份，避免反復(fù)融化導(dǎo)致活性降低甚至失活）②離心：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）③反應(yīng)：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min

使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合預(yù)變性：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定2.DNA片段電泳鑒定的原理：(1)帶電粒子：DNA分子具有___________，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上____________。(2)遷移動(dòng)力與方向：在____的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷_____的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是_____。(3)遷移速度：PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)

來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與_________、_____________和____等有關(guān)。(4)檢測(cè)：凝膠中的DNA分子通過(guò)_____，可以在波長(zhǎng)為______的_______下被檢測(cè)出來(lái)。可解離的基團(tuán)正電荷或負(fù)電荷電泳相反電場(chǎng)凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象探究·實(shí)踐一、實(shí)驗(yàn)原理（呈負(fù)相關(guān)）瓊脂糖凝膠電泳一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中DNA便向正極泳動(dòng)。(1)凝膠濃度：制成的瓊脂糖凝膠是一種帶孔的篩網(wǎng)狀多聚物。凝膠濃度越小，篩孔越大，DNA分子遷移速率就越高；凝膠濃度越大，篩孔越小，DNA分子遷移速率就越低。影響DNA遷移速率的因素(2)DNA分子的大?。寒?dāng)凝膠濃度相同時(shí)，較大的DNA分子因體積大，所占據(jù)的空間大，在穿過(guò)凝膠孔隙時(shí)會(huì)遇到較大的阻力，穿過(guò)孔隙相對(duì)困難，遷移速率低。反之，遷移速率就高。因此，電泳一段時(shí)間后，較大的DNA分子遷移距離小，離加樣孔近；而較小的DNA分子遷移距離大，離加樣孔遠(yuǎn)。相同大小的DNA分子則會(huì)聚集在凝膠同一特定的位置上。根據(jù)這一特性，可以把不同大小的DNA分子分離開來(lái)。(3)DNA的構(gòu)象:遷移速率：雙螺旋環(huán)狀DNA＞雙螺旋鏈狀DNA＞單鏈DNA。EB可插入DNA雙鏈堿基之間，形成EB-DNA復(fù)合物。該復(fù)合物在紫外線激發(fā)下，發(fā)射出紅橙色熒光。EB-DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度與DNA含量成正相關(guān)，根據(jù)熒光強(qiáng)度可粗略地估計(jì)樣品中DNA含量。（EB有劇毒）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定探究·實(shí)踐二、材料用具2.試劑:(2)電泳緩沖液(TAE或TBE)、凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑——溴酚藍(lán))、瓊脂糖核酸染料(常用核酸染料為EB即溴化乙錠)等電源+電泳槽瓊脂糖凝膠樣品孔緩沖液—4.配制瓊脂糖溶液瓊脂糖電泳緩沖液加熱至融化稍冷卻根據(jù)待分離DNA片段的大小，確定瓊脂