姐妹染色單體互換

實(shí)驗(yàn)二姐妹染色單體互換標(biāo)本制備與分析

2021/5/91實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1、初步掌握姐妹染色單體差別染色技術(shù)2、初步掌握SCE的觀察及分析方法3、了解SCE頻率變化的意義器材與試劑1、材料加BrdU的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本片2、器材用品光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、紫外燈、擦鏡紙3、試劑2×SSC溶液、吉姆薩染液、BrdU、香柏油、二甲苯2021/5/92實(shí)驗(yàn)原理

姐妹染色單體（sisterchromatid）：染色體在DNA復(fù)制之后產(chǎn)生的一對(duì)連在一起的染色單體。

姐妹染色單體互換（sisterchromatidexchange,SCE）：是指染色體復(fù)制過(guò)程中，同一條染色體的兩條姐妹染色單體在相同位置上發(fā)生的等位對(duì)稱(chēng)的片段交換（同源片段的交換）。SCE交換頻率是反映DNA損傷程度的最敏感指標(biāo)之一。由于SCE能靈敏地檢測(cè)染色體的變化，表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，還可以將姐妹染色單體互換頻率列為檢測(cè)致突變物、致癌物的常規(guī)指標(biāo)之一。2021/5/93SCE檢測(cè)原理：在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷酸，當(dāng)細(xì)胞的DNA復(fù)制時(shí)，BrdU可取代胸腺嘧啶而被摻入到新合成DNA鏈中。半保留復(fù)制的新鏈被BUdR摻入,當(dāng)細(xì)胞處于第二周期時(shí)，同一染色體的兩條姐妹染色單體，一條由雙股都含有BrdU的DNA鏈構(gòu)成，而另一條為單股含有BrdU的DNA鏈。B/B型鏈的DNA螺旋化程度降低，經(jīng)紫外線照射后與Giemsa的親和力降低，染色后BB型鏈比T/B型鏈著色淺而出現(xiàn)色差。復(fù)制第一周期復(fù)制第二周期未摻入BrdU的為白鏈，摻入的BrdU的為黃鏈DNA雙鏈TTTBTBTBBB2021/5/94實(shí)驗(yàn)步驟BrdU摻入：細(xì)胞培養(yǎng)24h后于培養(yǎng)液中加入BrdU，最終濃度10μg/ml，避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)?！囵B(yǎng)終止前2.5h加秋水仙素，秋水仙素終濃度為0.02μg/ml↓染色體制片紫外燈照射：取標(biāo)本玻片置于飯盒蓋內(nèi)，正面朝上，覆蓋擦鏡紙，加入2×SSC緩沖液降紙浸濕，移入56℃水浴鍋內(nèi)，紫外燈距離10cm，照射20min↓染色：取出照射后標(biāo)本，緩流水沖洗，pH6.82%Giemsa染液染色10min，自來(lái)水沖洗晾干1、SCE染色體標(biāo)本片制備2021/5/952、SCE觀察計(jì)數(shù)鏡下（油鏡）觀察中期分裂相時(shí)，注意區(qū)分各細(xì)胞周期分裂相的染色特點(diǎn)：①染色體的兩個(gè)單體均為深染的細(xì)胞記為第一周期的細(xì)胞；②染色體的兩個(gè)單體染色一深一淺的細(xì)胞為第二周期細(xì)胞；③部分染色體的兩個(gè)單體染色都為淺色的細(xì)胞為第三周期的細(xì)胞。復(fù)制第一周期復(fù)制第二周期未摻入BrdU的為白鏈，摻入的BrdU的為黃鏈DNA雙鏈TT型TB型TB型TB型BB型2021/5/96

選擇染色體分散良好、長(zhǎng)度適中、輪廓清晰、數(shù)目完整、分化良好的的第二周期的分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù)。人體姐妹染色單體交換（SCE）的計(jì)數(shù)方法：①凡是在染色單體端部出現(xiàn)互換，記為1次交換；②在染色單體中間出現(xiàn)互換，記為2次交換；③如果在著絲粒處發(fā)生交換，需判明是否為扭轉(zhuǎn)，不是扭轉(zhuǎn)的為著絲粒部位交換，記為1次交換。每一份標(biāo)本至少需要計(jì)數(shù)20~50個(gè)細(xì)胞的染色體，計(jì)算SCE平均交換頻率。SCE平均交換頻率（次/細(xì)胞）=交換總次數(shù)/細(xì)胞數(shù)2021/5/972021/5/982021/5/992021/5/9102021/5/911實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1、按常規(guī)書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒔忝萌旧珕误w色差染色原理、實(shí)驗(yàn)試劑材料、實(shí)驗(yàn)操作步驟、實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果中觀察計(jì)數(shù)