斑馬魚atlastin蛋白通過BMP信號(hào)通路抑制運(yùn)動(dòng)及脊索運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的形成

斑馬魚atlastin蛋白通過抑制BMP信號(hào)通路控制運(yùn)動(dòng)及脊索運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的形成為了更好地理解遺傳性痙攣性截癱(HSP),我們研究了atlastin的功能——該蛋白常參與青少年時(shí)期發(fā)病的HSP,使用的方法為分析atlastin的基因(atll)敲除后導(dǎo)致幼魚運(yùn)動(dòng)能力嚴(yán)重下降(先于脊索運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突形成異常)并伴有BMP信號(hào)通路明顯上調(diào)。過表達(dá)物阻斷BMP信號(hào)可以充分拯救atll嗎啉反義寡核苷酸(MO)注射調(diào)了保持BMP信號(hào)的平衡對(duì)脊椎動(dòng)物運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的形成和穩(wěn)定在神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元之間聯(lián)系的發(fā)生取決于生長的軸突找到的合適的靶點(diǎn)(常常位于較遠(yuǎn)距離上)的能力。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生中，和無脊椎動(dòng)物的多種細(xì)胞中。三種主要的內(nèi)分泌的形態(tài)發(fā)生因子，BMP、Wnt和Hedgehog家族在胚胎發(fā)生的早期決定了沿軀體軸線分經(jīng)發(fā)育晚期軸突的生長。特別是BMP分子還參與了線蟲和果蠅的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的引導(dǎo)和神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)的形成。最近在無脊椎動(dòng)物中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)了BMP信號(hào)通路和影響上/下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的神經(jīng)退行性疾病之間的聯(lián)系。遺傳性痙攣性截癱(HSP),肌萎縮性側(cè)索硬化癥和脊髓性肌萎縮癥的果蠅模型表明果蠅體內(nèi)的相關(guān)致病基因的產(chǎn)物干擾了NMJ處的BMP信號(hào)。的表型變異和遺傳異質(zhì)性。到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過40個(gè)HSP位點(diǎn)和21個(gè)痙攣性截癱基因(SPGs)。盡管這21種SPG基因編碼的蛋性遺傳的HSP(AD-HSP)的一個(gè)主要致病位點(diǎn)，在所有的AD-HSP家族中占10%。ATL1編碼atlastin(亦稱atlastin-1),分子量64-kDa,馬和錐體神經(jīng)元中含量豐富。到目前為止，已報(bào)道了ATL1的38種突變體，大多數(shù)通過單倍劑量不足引起早發(fā)的純AD-HSP,但也有突變體可導(dǎo)致三種復(fù)雜的AD-HSP和痙攣性腦癱。Atlastin是一種多聚網(wǎng)marker分子之間，以及沿著大鼠胚胎皮層神經(jīng)些成熟的神經(jīng)細(xì)胞中將Atl-1knockdown后會(huì)削弱軸突生長和神經(jīng)軸與融合。但究竟是那種機(jī)制是引起HSP的病因目前尚不清楚，為了研究atlastin在脊椎動(dòng)物中的功能，我們?cè)诎唏R中使用了loss-和gain-of-function分析。我們分離出斑馬魚的atllcDNA,確定了它在胚胎發(fā)生時(shí)期的表達(dá)模式，用反義嗎啉寡核苷酸進(jìn)行了knockdown實(shí)驗(yàn)。Atlastin敲除后導(dǎo)致斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)能力嚴(yán)重喪失，伴有脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突分叉增多。我們用人的受體的轉(zhuǎn)運(yùn)來抑制BMP信號(hào)通路。最后，在胚胎發(fā)育晚期，敲除后可以通過在受體水平用遺傳學(xué)方法或藥物阻斷BMP通路進(jìn)行拯救，這進(jìn)一步確定了BMP信號(hào)通路在HSP發(fā)生過程中的病理生結(jié)果斑馬魚atlastin的鑒定和表達(dá)情況我們使用BLAST搜索斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫并找出源的斑馬魚atl1基因。斑馬魚的這一基因由13個(gè)外顯子組成，編碼一個(gè)含562個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，與人類的相比表現(xiàn)出較高的保守性(77%一致，90%相似；補(bǔ)充圖1)。用原位雜交的方法，我們檢測(cè)了在體節(jié)發(fā)育后期atllmRNA的表達(dá)情況(圖1a),盡管蛋白印跡分析表明在囊胚期中期已有存在(圖1b和補(bǔ)充圖2),提示這種蛋白在斑馬魚中是母系表達(dá)。我是指那些在神經(jīng)管(包括從原始端腦到脊髓末端)中的進(jìn)行有絲分裂較高，在發(fā)育的大腦中分布廣泛(圖1a)。在發(fā)育的脊索中，atl1在不同的神經(jīng)元中表達(dá)水平不同，包括有絲分裂后的初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 Atlastin敲除后的解剖和行為表型為了研究atlastin-1在斑馬魚發(fā)育中的功能，我們用反義嗎啉寡核苷酸(MO,包括2種阻斷翻譯的靶向MO,其中一個(gè)阻斷atll第8外顯子和第8內(nèi)含子之間的剪接位點(diǎn))干擾其翻譯。每種MO注射相同的濃度，結(jié)果在注射過的胚胎(n>300)中85-90%出現(xiàn)了可重復(fù)射過MO的胚胎的水平顯著降低(圖1c和補(bǔ)充圖2)。在2細(xì)胞和4細(xì)胞期注射0.2-0.3pmol的atllMO的胚胎與未注射的胚胎和注射了5-bp對(duì)照MO的胚胎相比發(fā)育正常。由于脊索有絲分裂后力明顯下降(圖2a和補(bǔ)充視頻1)。與對(duì)照組胚胎觸碰后的反應(yīng)相比，MO胚胎運(yùn)動(dòng)明顯減慢，游泳距離較短(圖2b,c)。接下來我們用拯救實(shí)驗(yàn)評(píng)估了這種運(yùn)動(dòng)能力的喪失是否是由于atlastin-1的缺失所特與MO在1細(xì)胞期共注射，在受精72小時(shí)后(hourpostfertilizationhpf)分析胚胎的運(yùn)動(dòng)行為。人或斑馬魚atlastin-1的表達(dá)對(duì)幼魚的運(yùn)動(dòng)能力有完全的拯救(圖2和補(bǔ)充視頻1),這證明MO組游泳能力為了探明運(yùn)動(dòng)缺陷的原因，我們用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突標(biāo)記物znpl經(jīng)元軸突進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)(圖3a,b)。用znp1標(biāo)記的58-hpf的MO胚胎免疫組化結(jié)果顯示脊索運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突(SMNs)走行的路徑異常且沿著軸突伴有多個(gè)異常分叉(每次試驗(yàn)中n=20-25,重復(fù)3在拯救的胚胎中明顯減少(圖3c)。反過來，用乙?；疢O組SMN軸突末端缺乏穩(wěn)定的微管。Atl1敲除不僅導(dǎo)致56-58hpf胚胎向腹側(cè)投射的次級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元大量分叉，也導(dǎo)致24hpf初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元異常分支，然而功能性的神經(jīng)肌肉突觸的形成只有輕微的改變，正如神經(jīng)末梢位置乙酰膽堿受體的積累所示(n=31;補(bǔ)充圖3)。另外，90%的次級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元不能向嘴端投射，64%的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突在水平的肌節(jié)處異常成束，30%的MO幼魚出現(xiàn)異常的脊索運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突發(fā)出位點(diǎn)(n=30;補(bǔ)充圖3)。究了SMN軸突的異常結(jié)構(gòu)是否是脊索神經(jīng)元形成過程中受到影響的結(jié)果。在22hpf的對(duì)照組和MO組胚胎中用泛神經(jīng)markerHuC/D的抗體進(jìn)行免疫組化，沒有表現(xiàn)出明顯的不同(每組胚胎數(shù)n=25;補(bǔ)充表4)。同樣的，比較在體節(jié)發(fā)生時(shí)期MO組和對(duì)照組脊索腹側(cè)整個(gè)區(qū)域的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元前體的少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子-2(olig2)的表達(dá)量沒有表現(xiàn)出不同(每組n=10,補(bǔ)充圖4)。然而，atl1MO組有絲常定位(n=12/25;補(bǔ)充圖4)及22hpf胚胎脊索尾端腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的不規(guī)則分布(n=20/25;補(bǔ)充圖4),這提示MO組神經(jīng)元的早期遷移及定位方面有缺陷。隨后我們用抗磷酸-H3和蛋白酶3的抗體進(jìn)行對(duì)照組胚胎之間并未發(fā)現(xiàn)任何明顯的變化(補(bǔ)充圖5)。為了判斷atl1敲除是否導(dǎo)致其它神經(jīng)細(xì)胞的缺陷，我們用另外的抗體和轉(zhuǎn)基因品系對(duì)MO組進(jìn)行了研究。用3A10的抗體(特異性標(biāo)記Mauthner纖維)對(duì)MO組和對(duì)照組幼魚進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果未顯示任何明顯的不同(圖3d)。同樣的，用鰓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，Rohon-Bread感覺神經(jīng)元和脊索GABA能中間神經(jīng)元的特異性marker標(biāo)記也沒有在MO組和對(duì)照組胚胎之間表現(xiàn)出任何差異(補(bǔ)充圖6,atllMO組中小腦組織出現(xiàn)明顯缺陷(n=37/62;圖3b)。運(yùn)動(dòng)能力缺失的關(guān)系。我們用移植的方法制作帶有Hb9-GFP標(biāo)簽的大多數(shù)的在脊索腹側(cè)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺乏運(yùn)動(dòng)能力受限(n=62/77),運(yùn)動(dòng)情況與atllMO組的運(yùn)動(dòng)表型極其相似(圖4b,c及補(bǔ)充視頻2)。同樣在嵌合胚胎中出現(xiàn)SMN異常分支(圖4d)。這表明注射MO后的運(yùn)動(dòng)能力喪失涉及SMNs。Atlastin抑制BMP信號(hào)通路胚胎1細(xì)胞期過表達(dá)人或斑馬魚的atlastin-1。所有注射了30-50pg人ATL1或斑馬魚atllmRNA的胚胎表現(xiàn)出腹鰭缺失的表型(n=100;圖5a),這讓人聯(lián)想到與BMP信號(hào)突變有關(guān)。增加atll的濃度 (80-100pg)可引起更嚴(yán)重的表型：50%注射后的胚胎表現(xiàn)為腹部結(jié)突變的胚胎中過表達(dá)atll是否可以緩解上述腹部表型。注射atllmRNA到1細(xì)胞期的chordino'胚胎中可部分拯救軀干突變表型，所有注射的胚胎伴有腹側(cè)血島的積累減少(n=57;圖5,6)。我們檢測(cè)了在原腸胚形成期是否atl1的過表達(dá)會(huì)下調(diào)BMP信號(hào)分子，如磷酸化5d)。在60%外包期，與對(duì)照組相比(n=38),注射了atll的胚胎有93%出現(xiàn)了P-Smad1/5/8的明顯下調(diào)(n=40,圖5c),在80%外包期(圖5d)與對(duì)照組胚胎(n=146)相比，atl1過表達(dá)的胚胎有70%出現(xiàn)了GATA3表達(dá)區(qū)域的明顯減少。最后，過表達(dá)一種斷裂a(bǔ)tllmRNA(atlastin有GTP酶活性的區(qū)域缺失)不會(huì)產(chǎn)生異常表型，這提示組P-Smad1/5/8水平明顯上升(圖6a,b及補(bǔ)充圖2,7)。在atll過表 (補(bǔ)充圖7)。我們又在MO組蛋白提取物中檢測(cè)到BMPI型受體的含量明顯上升(圖6a,b和補(bǔ)充圖2)。為了更好地表明MO組中BMP信號(hào)的上調(diào)，我們?nèi)?4hpfMO組和對(duì)照組胚胎的脊索神經(jīng)元進(jìn)行原代培養(yǎng)，用免疫組化的方法對(duì)BMP通路中不同分子的含量和定位進(jìn)組神經(jīng)元中P-Smad1/5/8的含量明顯增加(2802.9±44.4AFU;P<0.0001),這證明atlastin抑制了BMP信號(hào)。為了解atlastin在斑馬魚中的亞細(xì)胞定位，我們用prim-5期胚胎的原代培養(yǎng)的脊索神經(jīng)元進(jìn)行免疫組化分析。在斑馬魚脊索神經(jīng)元中，atlastin-1呈點(diǎn)狀分布于胞體和突起內(nèi)的囊泡狀結(jié)構(gòu)上。這些atlastin(+)的囊泡沿著突起均勻的分布，在生長錐中的含量尤其豐Rab4和Rab7共定位(補(bǔ)充圖8)。我們又研究了的BMP信號(hào)組分共定位，發(fā)現(xiàn)在脊髓神經(jīng)元中均與分布的晚期內(nèi)體中，30%有atlastin與BMP受體I的部分共定位(圖7a,b)。這一結(jié)果結(jié)合atllMO組中BMP受體I的水平升高(圖6a),提示atlastin通過調(diào)節(jié)BMP受體的轉(zhuǎn)運(yùn)來抑制BMP信號(hào)。這與另一種HSP蛋白由于atlastin與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的融合有關(guān)，我們猜想是否atl1敲除會(huì)影響體內(nèi)膜的組分。然而MO組脊索神經(jīng)元(n=100)和成纖維細(xì)胞(n=100)與對(duì)照組相比并未發(fā)現(xiàn)早/晚期內(nèi)體形態(tài)學(xué)和分布上有明顯的改變(補(bǔ)充圖9)。通過抑制BMP信號(hào)拯救atlastin表型為研究atlMO組的運(yùn)動(dòng)及SMN表型是否是由BMP信號(hào)的上調(diào)引起的，我們檢測(cè)了是否抑制BMP通路可以緩和MO組的表型。用系表達(dá)一種顯性負(fù)性作用的BMP受體I(DN-BMPRI),其表達(dá)受熱休克誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制。我們將MO組及對(duì)照組胚胎各分出一半在32-36hpf時(shí)熱休克處理，然后在72hpf用為尾部觸碰反應(yīng)評(píng)價(jià)這四種胚胎的運(yùn)動(dòng)能力。經(jīng)熱休克處理的atl1MO(DN-BMPRI)組幼魚超過90%表現(xiàn)出與經(jīng)同樣處理的對(duì)照組幼魚相似的正常運(yùn)動(dòng)能力，而(圖8a-c及補(bǔ)充視頻3)。與注射了atl1mRNA的MO組胚胎一樣，MO(DN-BMPRI)組胚胎通過抑制BMP信號(hào)而得到完全拯救(補(bǔ)充視頻1和3)。我們接下來用抗乙?；痑-tubulin及znp1的抗體，用免疫組化的方法研究了56hpf的各組(DN-BMPRI)胚胎SMN軸突的情況。熱休克處理的MO(DN-BMPRI)組與對(duì)照組相比SMN軸突正常。相反，未處理MO(DN-BMPRI)組胚胎出現(xiàn)異常的SMN進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)軸突斷裂且難以觀軸突斷端(圖8e,f)。在每組胚胎中，我們各選12個(gè)，每個(gè)胚胎選擇肛門部位的8個(gè)體節(jié)對(duì)軸突斷端及分支情況進(jìn)行計(jì)數(shù)。熱休克MO組(DN-BMPRI)與未處理MO組比較，斷端及分支數(shù)目明顯減少 (P<0.001,t檢驗(yàn))。但與熱休克處理的對(duì)照組胚胎(DN-BMPRI)為了研究BMP信號(hào)在斑馬魚SMN發(fā)育中的作用，我們用dorsomorphin(一種可使BMP受體失活的小分子)處理MO組及對(duì)照組胚胎以阻斷BMP通路。MO組及對(duì)照各分成3組，在16-18體或DMSO處理的MO組胚胎表現(xiàn)為明顯的運(yùn)動(dòng)能力喪失(補(bǔ)充表2)。這表明阻斷BMP信號(hào)通路可完全拯救atl1MO表型，說明BMP信BMP信號(hào)在果蠅運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育過程中特異性的參與軸突運(yùn)輸及微管網(wǎng)絡(luò)的組織。然而，直到現(xiàn)在尚未發(fā)現(xiàn)BMP信號(hào)通路在脊椎動(dòng)種敲除后的表型可以通過下調(diào)BMP信號(hào)來拯救。我們的發(fā)