2018微生物檢驗(yàn)技術(shù)師考點(diǎn)

1.儀器的標(biāo)識(shí)管理：紅（停用）黃（準(zhǔn)用）綠（合格）各自所表

明的狀態(tài)。

2.分光光度計(jì)檢測細(xì)菌濃度用可見光分光光度計(jì)，測細(xì)菌波長用

600nmo檢測蛋白用紫外分光光度計(jì)（波長用280nm）,它

也可測核酸濃度（波長260nm）o選定分光光度計(jì)測定顏色反應(yīng)

光的波長是450nm。石英比色皿用于紫外分光光度計(jì)，玻璃比色

皿用于可見光分光光度計(jì)。

3.紫外透射儀該儀器使用條件是暗室和紫外線，主要用于

在紫外線下看DNA條帶。

4.色譜氣相色譜可做微生物分類和鑒定，用于微生物的化學(xué)成

分分析。液相色譜儀也可做微生物化學(xué)成分分析。質(zhì)譜儀也可做微生

物化學(xué)成分分析。

5.測序儀蛋白測序儀測定氨基酸排列順序，DNA測序儀是測

核昔酸排列順序。能做DNA測序的物質(zhì)是質(zhì)粒、噬菌體、PCR產(chǎn)

物。

6.擴(kuò)增儀PCR是聚合酶鏈反應(yīng)縮寫，能做PCR稱DN

A擴(kuò)增儀。它能以一定DNA片段為模板，變換溫度，擴(kuò)增該片段。

常用的“槍”是實(shí)驗(yàn)室常用的微量可調(diào)移液器。

7.酶標(biāo)做ELISA的儀器稱酶標(biāo)儀，做EUSA反應(yīng)，其中

主要設(shè)備有塑料凹孔板、洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。

8.電泳類別醋酸纖維膜電泳可用于免疫球蛋白鑒定，瓊脂免

疫電泳用于蛋白分離和鑒定，對(duì)流免疫電泳可測抗原或抗體，火箭電

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泳測抗原量，交叉定量免疫電泳測抗原量。IFE是等電聚焦電泳。

PFGE是脈沖電場凝膠電泳，PAGE是聚丙烯酰胺凝膠電泳。

9.PAGE用于蛋白和核酸分離，原理是凝膠介質(zhì)形成立體

多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩和電泳作用。分離條帶上邊是大分子，下

邊是小分子物質(zhì)。過硫酸鏤在PAGE制備起催化聚合作用。SDS

-PAGE是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，它用于蛋白分離,

在此電泳中，丙烯酰胺濃度越大，線性分離范圍越??；該物濃度越小，

線性分離范圍越大，十二烷基硫酸鈉作用是解離蛋白，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白做

標(biāo)識(shí)測驗(yàn)電泳條帶分子量。在SDS-PAGE中常用蛋白染料是考

馬斯亮藍(lán)，硝酸銀也是其常用染料。該電泳中緩沖液重要成分為甘氨

酸。

10、等電聚焦電泳其原理是以兩性電解質(zhì)制造凝膠有不同P

H,使帶不同電荷的多肽在電泳條件下于等電點(diǎn)停留。兩性電解

質(zhì)是制備該電泳凝膠不同PH重要物質(zhì)，用聚丙烯酰胺制備等電聚焦

電泳凝膠。這種電泳主要用于蛋白質(zhì)分離。

11、脈沖電泳脈沖電泳用于核酸分離，其優(yōu)點(diǎn)是分離大片段

核酸。用瓊脂糖制備該電泳凝膠的介質(zhì)。這種電泳的電場為正交的交

變脈沖電場。脈沖電場凝膠電泳條帶靠近負(fù)極為大片段DNA,靠近

正極為小片段DNA。DNA染色可用浪化乙錠，也可用硝酸銀。因

澳化乙錠有致癌作用，故在使用時(shí)應(yīng)注意。丙烯酰胺具有神經(jīng)毒，在

用時(shí)注意個(gè)人防護(hù)。

12、瓊脂糖凝膠電泳此電泳用于核酸分離與純化，用水平電

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泳槽。分離DNA片段最佳范圍為200bp?50kb。

13、聚丙烯酰胺電泳該電泳通常用垂直電泳槽，分離DNA片

段是最佳范圍是5?500bpo

14.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB19489—2004《實(shí)驗(yàn)室生物安全

通用要求》根據(jù)生物因子對(duì)個(gè)體和群體的危害程度將其分為4級(jí)：

危害等級(jí)I（低個(gè)體危害，低群體危害）不會(huì)導(dǎo)致健康工作者和

動(dòng)物致病的細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等生物因子。

危害等級(jí)H（中等個(gè)體危害，有限群體危害）能引起人或動(dòng)物發(fā)

病，但一般情況下對(duì)健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會(huì)引起嚴(yán)重危

害的病原體。實(shí)驗(yàn)室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和預(yù)防措施,

并且傳播風(fēng)險(xiǎn)有限。

危害等級(jí)m（高個(gè)體危害，低群體危害）能引起人或動(dòng)物嚴(yán)重疾

病，或造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，但通常不能因偶然接觸而在個(gè)體間傳播,

或能用抗生素抗寄生蟲藥治療的病原體。

危害等級(jí)IV（高個(gè)體危害，高群體危害）能引起人或動(dòng)物非常嚴(yán)

重的疾病，一般不能治愈，容易直接、間接或因偶然接觸在人與人,

或動(dòng)物與人，或人與動(dòng)物，或動(dòng)物與動(dòng)物之間傳播的病原體。

15.保存的病原微生物菌（毒）種要按規(guī)定進(jìn)行登記、上報(bào)和

核準(zhǔn)，實(shí)行雙人雙鎖管理和使用審批制度。保存和使用各類病原

微生物菌（毒）種的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和設(shè)施條件,

并在二級(jí)以上生物安全柜中操作。細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室在污染情況超過許可程

度時(shí)，通常采取甲醛熏蒸消毒。

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病毒篇

1.用于病毒分離的材料，無論是傳代病毒培養(yǎng)物，還是采自發(fā)病

或死亡動(dòng)物的病料，都應(yīng)盡快送往實(shí)驗(yàn)室作病毒分離或鑒定。組織細(xì)

胞或動(dòng)物接種和傳代可以應(yīng)用于病毒的分離和鑒定。病毒對(duì)細(xì)胞的感

染性具嚴(yán)格的選擇性和特異性，因此用組織培養(yǎng)細(xì)胞接種病毒必須首

先選擇敏感細(xì)胞。

(1)病毒增殖的判定：病毒在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體和組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增

殖，顯然都會(huì)影響機(jī)體和細(xì)胞的代謝和生命活動(dòng)，并且經(jīng)常通過一定

的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)變化表現(xiàn)出來。

(2)細(xì)胞病變(CPE)：大部分病毒在敏感細(xì)胞系均可出現(xiàn)CPE,

CPE可以表現(xiàn)為嚴(yán)重的細(xì)胞破壞、細(xì)胞腫大、顆粒增多、細(xì)胞融合成

合胞體或無明顯的細(xì)胞變化等。CPE經(jīng)常具有病毒“種”的特性，因

此常常作為病毒鑒定的依據(jù)之一。

(3)病毒蝕斑(又稱空斑)技術(shù)：病毒蝕斑是指病毒在已長成

的單層細(xì)胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的純化或病毒懸液中

感染病毒含量的測定。

(4)病毒感染力的滴定：常用的病毒感染力的滴定有兩種方法，

一種方法是用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測定LD50(半數(shù)致死量)，另一種方法是在組

織細(xì)胞上測定TCID50(半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量)。

(5)病毒的保存：分離或鑒定后的病毒經(jīng)過冷凍干燥后可以長

期保存。

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2.病毒形態(tài)學(xué)檢查快速有效的標(biāo)本制作技術(shù)故然重要，但

更需要識(shí)別病毒結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗(yàn)。病毒形態(tài)學(xué)檢查方法主要有：

(1)光學(xué)顯微鏡僅用于大病毒顆粒(如痘類病毒)和病毒

包涵體的檢查。

(2)電子顯微鏡檢查法

(3)超過濾法用不同孔徑的火棉膠濾膜過濾病毒懸液，將

獲得的濾液接種于組織細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或雞胚，或用血凝試驗(yàn)來測定

病毒是否通過濾膜，從而估計(jì)病毒的大小。

(4)超速離心法根據(jù)病毒大小的不同，其沉降速度也不同。

可用超速離心法測得病毒的沉降系數(shù)(S),借以計(jì)算病毒的大小。

(5)X線晶體衍射法但標(biāo)本必須為結(jié)晶，可用于無包膜病毒

的研究。

3.免疫學(xué)鑒定

4.病毒的分子生物學(xué)鑒定分子生物學(xué)診斷的特異性取決于

核酸序列的特異性，病毒的分子生物學(xué)鑒定，包括對(duì)病毒核酸和蛋白

質(zhì)的測定。核酸測定主要使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、探針技術(shù)和核

酸序列測定，檢測病毒基因組中的特征性區(qū)段甚至整個(gè)病毒基因組;

而蛋白質(zhì)測定可使用免疫測定技術(shù)、電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，檢測病毒

特異的蛋白質(zhì)成分。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、雞胚以及體外培養(yǎng)的器官和細(xì)胞都可以作為人工增

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殖病毒的基本工具。而大量病毒的培養(yǎng)，又是病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究以及制

備疫苗和特異性診斷試劑的先決條件。

1.組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)用的玻璃器皿要求比較嚴(yán)格，要用硫酸和

重酪酸鉀溶液浸泡后再清洗應(yīng)用。常用的人工綜合營養(yǎng)液為MEM和

RPMH640。用人工綜合營養(yǎng)液配制細(xì)胞生長液時(shí)需要加入適量血清和

谷氨酰胺溶液，還需要加入規(guī)定量的抗生素溶液防止細(xì)菌污染，加人

碳酸氫鈉溶液修正pH,根據(jù)情況還可加入HEPES溶液可使生長液具

有較強(qiáng)的pH緩沖能力。能使組織和成片細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞的化學(xué)

制劑為胰蛋白酶和EDTA,EDTA使用液又可稱之為Versen溶液，其分

散細(xì)胞的作用原理是EDTA可以結(jié)合鈣、鎂離子，使組織細(xì)胞分散。

動(dòng)物血清中具有細(xì)胞生長所必需的各種營養(yǎng)因子，它能促進(jìn)細(xì)胞的貼

壁和生長，且有很強(qiáng)的酸堿緩沖能力。細(xì)胞培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)過程中

可分為細(xì)胞生長液和細(xì)胞維持液兩種。生長液是使細(xì)胞發(fā)育增殖的液

體，因此要求營養(yǎng)條件豐厚；維持液用于延緩細(xì)胞代謝，從而延長細(xì)

胞的存活時(shí)間，以利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。這兩種液體成分的主要區(qū)別是血

清含量不同。細(xì)胞生長適宜的pH范圍是pH7.2?7.6。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

全過程的關(guān)鍵是防止污染。

2.細(xì)胞株的保存二甲基亞碉是細(xì)胞低溫保存的良好的保護(hù)劑,

含10%二甲基亞颯的血清可以作為懸浮細(xì)胞的液體在液氮中保存細(xì)

胞。

3.病毒學(xué)上常用的細(xì)胞類型可分為原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和

傳代細(xì)胞三大類，原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)的根本區(qū)別在于細(xì)胞

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是否能在體外無限傳代。

4.細(xì)胞的純化細(xì)胞的純化可以用細(xì)胞克隆技術(shù)?？寺∈?/p>

指用無性繁殖方法產(chǎn)生的一組遺傳上相同的細(xì)胞和生物群體的過程。

分子雜交，常規(guī)的細(xì)菌篩選和各種雜交時(shí)多選用硝酸纖維素濾膜

作為固相支持體。

(1)Southern雜交被檢對(duì)象為DNA,探針為DNA或RNA。

(2)Northern雜交被檢對(duì)象為RNA,探針為DNA或RNA。

PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)包括三個(gè)基本步驟，即：模板DNA的

變性、模板DNA與引物的退火復(fù)性、引物的延伸。

PCR反應(yīng)體系包括5種基本成分，依次為：引物、DNA聚合酶、

dNTP、模板DNA、Mg2+O

1、引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取

決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度：15-30bp,常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至

10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,

G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的喋

吟或口密咤核甘酸的成串排列。

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④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'

端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要

求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適

宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同

源性。

引物量:每條引物的濃度0.1?lumol或10?lOOpmol,以最低

引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。

2、酶目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿

菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型

的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)），濃度過高可

引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

3、dNTPdNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP

粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，

在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50—200umol/L,

4、模板模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)

節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)

本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜

蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合

而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，

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再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙

醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測

標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色

體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采

用異硫氧酸胭或蛋白酶K法，要防止Rnase降解RNA。

5、Mg2+濃度

Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反

應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),Mg中濃度為1.5?衣Ommol/L

為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低

會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

基因芯片也稱為基因微陣列技術(shù)，指采用原位合成或顯微打印手

段，將數(shù)以萬計(jì)的靶基因或寡核昔酸片段固化于支持物表面上，產(chǎn)生

探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過監(jiān)測雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)

生物樣品進(jìn)行快速、并行、高效檢測或醫(yī)學(xué)診斷?；蛭㈥嚵屑夹g(shù)主

要包括四個(gè)基本技術(shù)環(huán)節(jié)：芯片微陣列制備、樣品的準(zhǔn)備和標(biāo)記、生

物分子反應(yīng)和信號(hào)的檢測及數(shù)據(jù)分析處理。

雖然基因芯片技術(shù)在微生物診斷中存在一定的不足，但還存在很

大的應(yīng)用前景，其在微生物診斷中，具有以下優(yōu)越性：1）高通量，

可以同時(shí)對(duì)多種微生物進(jìn)行監(jiān)控。2）多條探針的分子雜交，可以有

效的克服PCR易被污染的特點(diǎn)，從而提高了特異性。3）可以克服窗

口期漏檢情況的發(fā)生。特別是將其應(yīng)用于對(duì)幾種微生物的多重感染的

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診斷上，和鑒定新的病原微生物上，如在SARS病毒的鑒定中發(fā)揮了

很大的作用。

一、DNA的復(fù)制和修復(fù)細(xì)胞每分裂一次，染色體DNA就合成

一次。DNA分子拆開成兩條鏈，每一條單鏈按照堿基配對(duì)的原則合成

另一條新單鏈，成為半保留復(fù)制。在體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)必須有RNA引物。

二、轉(zhuǎn)錄在生物體內(nèi)，DNA指導(dǎo)的RNA合成過程稱為轉(zhuǎn)錄。

它是按照儲(chǔ)存在DNA上遺傳信息合成。合成RNA時(shí)DNA雙鏈也要解旋,

解旋部位稱啟動(dòng)子。

三、翻譯在合成各種不同RNA中，tRNA具有搬運(yùn)氨基酸功能。

構(gòu)成核糖體骨架的是rRNA,而mRNA直接決定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。4種核

甘酸排列組成遺傳信息，合成蛋白質(zhì)時(shí)轉(zhuǎn)換成20種氨基酸的排列順

序，遺傳信息的這種轉(zhuǎn)換稱為翻譯。3個(gè)核甘酸排列順序代表一種氨

基酸密碼，表示蛋白質(zhì)合成開始的密碼有一種，DNA三個(gè)終止密碼子

分別是UAA、UAG、UGAo在細(xì)菌里，依靠rRNA和mRNA之間一段互補(bǔ)

序列能發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成開始的位置。原核生物核糖體是由16SrRNA、

23SrRNA和5SrRNA組成。在真核生物核糖體的五種主要的組蛋白中，

H1在進(jìn)化中最不保守。限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限

制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈

DNAo它可分為三類，其中II類限制性內(nèi)切酶在分子克隆和微生物鑒

定中得到了廣泛應(yīng)用。絕大多數(shù)II類限制酶識(shí)別長度為4或6個(gè)核昔

酸的回文對(duì)稱特異核甘酸序列。DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后.產(chǎn)生許

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多一定長度的片段，使用電泳的方法分離不同長度的片段，一種DNA

結(jié)構(gòu)就能形成一種特征性的圖形，稱為DNA的電泳圖譜。

瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可

分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在

強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。

聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5?500bp)效果較好，其分辨力極

高，甚至相差I(lǐng)bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠通常采用垂

直裝置進(jìn)行電泳。

電泳完畢后，使用濱化乙咤染色，DNA片段聚集的地方，在紫外

光下可以顯示發(fā)橙色熒光的條帶。如果電泳中使用了已知大小的DNA

片段作為分子量標(biāo)志，可以測量并計(jì)算出每一DNA片段的長度。結(jié)合

使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析將這些片段排列起來，便可作

出DNA的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜。

DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位

置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。

分子生物學(xué)基本技術(shù)知識(shí)點(diǎn)一一質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定

質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從「200kb不等，為

雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主

要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，

能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒

的存在使宿主具有一些額外的特性，如致病的能力和對(duì)抗生素的抗性

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細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的

方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞;

分離和純化質(zhì)粒DNA。

抗體檢測知識(shí)點(diǎn)一一抗體檢測方法

（一）中和反應(yīng)中和反應(yīng)不僅測定抗體是否存在，而且測

定抗體是否具有免疫保護(hù)作用，因而，盡管這種方法復(fù)雜費(fèi)時(shí)，影響

因素眾多而且不穩(wěn)定，在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是病毒性疾病中，仍然是

不可取代的抗體檢測方法。中和試驗(yàn)的基本方法是，將待檢物質(zhì)

與活的致病微生物混合，感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，然后觀察實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物是否發(fā)病、死亡，或細(xì)胞是否發(fā)生病變。在結(jié)果的解釋中應(yīng)當(dāng)注

意，細(xì)胞的中和試驗(yàn)通常只反應(yīng)抗體阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力，這只

是病毒致病過程中的一小部分。

（二）沉淀反應(yīng)血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可

溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)沉淀物，這類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。該類

反應(yīng)可檢測到20?2mg/ml水平的抗體。較常用的檢測方法有：

1.單向免疫擴(kuò)散將一定量已知抗原混于瓊脂中制成瓊脂板,

在適當(dāng)位置打孔后將抗體加入孔中擴(kuò)散，抗原抗體在擴(kuò)散過程中形成

以抗體孔為中心的沉淀環(huán)，可用于檢測血清中的IgG、IgM、IgA和補(bǔ)

體C3等的含量。

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2.雙向免疫擴(kuò)散將抗原與抗體分別加于瓊脂凝膠中，二者

自由向四周擴(kuò)散，在相遇處形成沉淀線?？捎糜诳贵w的定性、定量檢

測。

（三）凝集反應(yīng)細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合

后形成凝集團(tuán)塊，這一類反應(yīng)稱為凝集反應(yīng)。

1.直接凝集將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)

細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。檢測方法有兩種：一是玻片凝集試驗(yàn)，用于

定性測抗原，多用于快速診斷；二是試管凝集試驗(yàn)，在試管種系列稀

釋待檢血清，加入已知顆?？乖ㄋ谰蚧罹?，多用死菌），進(jìn)行的

血清反應(yīng)，用于定量檢測抗體。溫箱中放24小時(shí)后取出反應(yīng)管在室

溫放2個(gè)小時(shí)再判斷為宜，判定凝集滴度以凝集程度為++而定。

2.間接凝集將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表明，

與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集的現(xiàn)象。

（四）補(bǔ)體參加的反應(yīng)利用抗體與紅細(xì)胞上的抗原結(jié)合，激

活反應(yīng)體系中的補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞的溶解，用溶血現(xiàn)象作為指示系統(tǒng)

幫助結(jié)果判定。常用的方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和溶血空斑試驗(yàn)。

（五）用標(biāo)記抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)

利用熒光素、酶或放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行

的抗原抗體反應(yīng)。靈敏度高、快速，可定性或定量，甚至定位等優(yōu)點(diǎn)。

1.免疫熒光將已知細(xì)菌、感染病毒的細(xì)胞等顆?？乖裙潭ㄓ?/p>

載玻片，加待檢血清反應(yīng)后，再加熒光素標(biāo)記的抗抗體，置熒光

顯微鏡下觀察判定，用于檢測抗體。

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2.酶免疫測定是用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)?？?/p>

用目測定性，也可用酶標(biāo)測定儀測定光密度（0D）值以反應(yīng)抗體

的含量，敏感度可達(dá)ng/ml甚至pg/mlo常用于標(biāo)記的酶有辣根

過氧化物酶、堿性磷酸酶等。常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（EUSA）。

采用雙抗體夾心法或間接法檢測特異抗體。

3.放射免疫測定法用放射性的核素（1251和1311）標(biāo)記抗

原，檢測抗體，靈敏度達(dá)pg/ml。

4.免疫印跡法將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳區(qū)分的

蛋白質(zhì)抗原轉(zhuǎn)移置NC或PVDF等膜上。檢測特異的抗體。用該法

檢測血清HIV抗體為診斷HIV感染的方法之一。

細(xì)胞免疫檢驗(yàn)知識(shí)點(diǎn)一一淋巴細(xì)胞的分離與類型鑒定體外檢測

淋巴細(xì)胞，需要先制備外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMc）,制備PBMC常用的

方法是葡聚糖一泛影葡胺（淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法。以下

方法通過檢測淋巴細(xì)胞的某些表面標(biāo)志，可確定細(xì)胞的不同類型。

1.免疫熒光法2.磁珠分離法3.陶選法4.流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞免疫檢驗(yàn)知識(shí)點(diǎn)一一免疫細(xì)胞功能測定

（一）T細(xì)胞功能測定

1.T細(xì)胞增殖試驗(yàn)

2.細(xì)胞毒試驗(yàn)（1）51Cr釋放法（2）乳酸脫氫酶釋放法

（3）皮膚試驗(yàn)：根據(jù)局部紅腫為特征的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強(qiáng)度檢測。

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常用的生物性抗原常從病原體中提取，如結(jié)核菌素、麻風(fēng)菌素等。

(二)B細(xì)胞功能測定1.B細(xì)胞增殖試驗(yàn)B細(xì)胞受絲裂原刺

激后，進(jìn)行分裂增殖，溫育一定時(shí)間后檢查抗體形成細(xì)胞的數(shù)目。

2.抗體形成細(xì)胞測定常用的溶血空斑試驗(yàn)測定。將-SRBC、待檢

B細(xì)胞、補(bǔ)體及適量瓊脂糖液混合，傾斜平皿，溫育1?3小時(shí)后，

肉眼觀測分散的溶血空斑出現(xiàn)，每一空斑中央含一個(gè)抗體形成細(xì)胞,

空斑的數(shù)量即為抗體形成細(xì)胞數(shù)。

常用儀器知識(shí)點(diǎn)一一生物培養(yǎng)類

1.普通培養(yǎng)箱分為隔水式和直熱式兩種，隔水式培養(yǎng)箱采用

浸入式電熱管隔水加溫，箱內(nèi)各部溫度恒定均勻，為實(shí)驗(yàn)室首選；直

熱式培養(yǎng)箱是以電爐絲直接加熱，箱內(nèi)上下層溫度相差較大，指示用

溫度計(jì)不能真實(shí)指示底層溫度。

用途：用于普通需氧和兼性厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)。當(dāng)室溫低時(shí)，也可用于

真菌培養(yǎng)。但細(xì)菌和真菌不可在同一培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用時(shí)注意事項(xiàng)：

(1)箱體必須有效接地，避免將水濺在內(nèi)層玻璃門上，以防玻璃受

驟冷而爆裂。

(2)隔水式培養(yǎng)箱在通電前，一定要先加水(以蒸儲(chǔ)水或去離子水

為宜)，否則會(huì)燒壞電熱管，經(jīng)常觀察水位指示浮標(biāo)，水位不足時(shí)，

及時(shí)補(bǔ)足水量。

(3)箱內(nèi)的培養(yǎng)物不宜放置過擠.以利冷熱空氣對(duì)流不受阻塞，保

持箱內(nèi)溫度均勻。培養(yǎng)時(shí)，打開箱體頂部的通風(fēng)口，避免箱內(nèi)濕度過

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大。

(4)如箱內(nèi)溫度不穩(wěn)定，可檢查溫度控制器的接點(diǎn)或請(qǐng)專人檢修。

(5)使用時(shí)應(yīng)早晚觀測箱內(nèi)溫度各一次，每次觀測后記錄箱內(nèi)實(shí)際

溫度。

(5)培養(yǎng)箱使用后要定期消毒，以免交叉污染，影響檢測結(jié)果。

2.真菌培養(yǎng)箱是氣溫過高地區(qū)培養(yǎng)霉菌和酵母菌的必備設(shè)備。

配有加熱、制冷、加濕、消毒系統(tǒng)，可自動(dòng)調(diào)節(jié)溫度，控制濕度、定

時(shí)消毒、自動(dòng)換氣等。當(dāng)室溫高于35c時(shí)-，也可用于培養(yǎng)細(xì)菌。但

真菌和細(xì)菌不可在同一培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用時(shí)注意事項(xiàng)：

(1)接通電源后，打開開關(guān)，設(shè)定溫度，并用測量開關(guān)測量箱內(nèi)實(shí)

際溫度。

(2)開機(jī)一段時(shí)間后加熱和制冷兩燈均不亮，表示箱內(nèi)溫度達(dá)到平

衡；如兩燈同時(shí)亮，表示機(jī)器故障，須請(qǐng)專業(yè)人員檢修。

(3)在箱內(nèi)取放物品時(shí)，切勿碰撞探頭，以免影響靈敏度。

(4)在制冷裝置啟動(dòng)時(shí)，如有異常聲音，應(yīng)立即停機(jī)檢修。

(5)儀器使用時(shí)應(yīng)每天兩次(早、晚各一次)觀測記錄箱內(nèi)實(shí)際溫

度，并由使用人和保管人簽字。

(6)每批培養(yǎng)物培養(yǎng)后，要定期對(duì)培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行消毒，以免交叉污

染。

3.恒溫振蕩培養(yǎng)箱需恒溫振蕩培養(yǎng)的微生物可用此培養(yǎng)箱

培養(yǎng)。其內(nèi)部有冷、熱氣流風(fēng)道使箱內(nèi)氣體循環(huán)流暢，溫度比較均勻。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)需要選擇相應(yīng)溫度范圍和振蕩頻率的培養(yǎng)箱使用。

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使用時(shí)注意事項(xiàng)：

(1)設(shè)備要求工作地面平整且后部有散熱空間，切勿沖擊散熱片。

(2)設(shè)備移動(dòng)時(shí)要平行移動(dòng)，任一方向不可傾斜大于45度。

(3)搖盤上的螺釘要經(jīng)常檢查，以免所夾物品脫落。

(4)如長期工作在“制冷”狀態(tài)時(shí)或停機(jī)三個(gè)月以上，要按期做加

熱驅(qū)潮處理，每隔兩周一次。

(5)使用中定時(shí)觀測箱內(nèi)溫度和轉(zhuǎn)速，并做記錄。

(6)如發(fā)生故障，應(yīng)由專業(yè)人員檢修。

4.厭氧(C02)培養(yǎng)箱主要用于厭氧菌、微需氧菌等的培

養(yǎng)。一般由控溫、抽空、細(xì)菌過濾、細(xì)菌培養(yǎng)罐以及箱外的各種壓縮

氣體鋼瓶組成。使用時(shí)注意事項(xiàng)：

(1)N2、C02鋼瓶可立于箱體旁與箱體相連，H2鋼瓶應(yīng)另置安全

處，以免發(fā)生危險(xiǎn)，用時(shí)用橡皮袋取出少許，與上述鋼瓶配用。

(2)作厭氧培養(yǎng)時(shí)，打開培養(yǎng)罐門，將已接種好的培養(yǎng)物放人罐

內(nèi)并迅速放人催化劑鋁粒、干燥劑、亞甲基藍(lán)指示劑，關(guān)閉罐門并扭

緊。

(3)打開此罐的電磁閥開關(guān)和真空泵開關(guān)，抽氣至真空度達(dá)到

93.3kPa時(shí),關(guān)閉真空泵開關(guān)。

(4)開啟N2輸氣閥，慢慢開啟N2鋼瓶和減壓閥，使罐內(nèi)充滿N2

氣，關(guān)閉N2氣，開啟真空泵抽氣，然后再用N2充氣一次。

(5)第三次按N280%、H210%、C0210%充氣。待指針回至零

位時(shí)關(guān)閉輸氣閥，再關(guān)減壓閥和電磁閥。不可出現(xiàn)負(fù)壓，影響厭氧環(huán)

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境。

(6)選擇所需溫度，進(jìn)行培養(yǎng)。

(7)在培養(yǎng)過程中不可打開培養(yǎng)罐門。以免破壞厭氧環(huán)境。

(8)使用過程中要經(jīng)常觀測培養(yǎng)箱內(nèi)溫度，并進(jìn)行記錄。

常用儀器知識(shí)點(diǎn)一一顯微成像類

1.顯微鏡可分為普通光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)觀

測項(xiàng)目不同選擇相應(yīng)的類型。利用光的衍射作用，以可見光為照明光

源的普通光學(xué)顯微鏡的分辨極限為200nm,可觀測細(xì)菌和細(xì)胞，但對(duì)

于細(xì)菌和細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)以及病毒，光鏡無法辨認(rèn)；電鏡以電子束為照

明光源，其波長極短，可有效提高其分辨率，達(dá)到0.2nm,用電磁透

鏡代替玻璃透鏡。

2.暗視野顯微鏡可分辨0.04微米的物體，微生物實(shí)驗(yàn)室多

用于觀察未染色標(biāo)本活的細(xì)菌、真菌等，并可觀察活細(xì)胞內(nèi)的線粒體

及細(xì)菌鞭毛的運(yùn)動(dòng)。但其只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能看清其細(xì)

胞結(jié)構(gòu)。載玻片厚度為1.0mm,且載玻片和蓋玻片需清潔無劃痕；

標(biāo)本濃度不宜過濃。

3.熒光顯微鏡熒光顯微鏡是利用熒光光源(紫外光)作為

激發(fā)光，透過經(jīng)熒光色素染色的標(biāo)本，輻射出比激發(fā)光的波長較長的

熒光，經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)放大后，可觀察其可見的熒光圖像，可分辨標(biāo)本內(nèi)

一些物質(zhì)的性質(zhì)與位置。

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常用儀器知識(shí)點(diǎn)一一滅菌、消毒類

濾菌器是利用微孔濾膜的微小孔徑通過抽濾或壓濾，將微生物阻

留在濾膜上，以便進(jìn)一步培養(yǎng)分析。從材質(zhì)的不同可分為玻璃濾菌器

和金屬濾菌器等；從工作原理的不同可分為負(fù)壓抽濾和正壓壓濾。

1.超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)是微生物實(shí)驗(yàn)室通常使用的無菌

操作臺(tái)，比一般的無菌操作室更潔凈.其潔凈度可達(dá)百級(jí)。超

凈工作臺(tái)采用層流技術(shù)凈化空氣，分為水平式和垂直式，在層流

有效區(qū)內(nèi)保持無菌環(huán)境。但不能保證微生物不污染環(huán)境和操作人

員。而另加一套空氣回收系統(tǒng)的生物安全凈化工作臺(tái)，可避免被

檢材料污染環(huán)境和操作人員。

2.生物安全柜生物安全柜可提供樣品和工作人員的雙重保

護(hù)。過濾后的潔凈氣流從安全柜頂部吹下，通過工作區(qū)域，在到

工作人員的呼吸區(qū)域前被俘獲。氣流在放空前將被過濾,一般情況

下過濾后的空氣將被排回實(shí)驗(yàn)室。超凈工作臺(tái)提供的是對(duì)樣品的

保護(hù)，對(duì)操作者和環(huán)境是不提供保護(hù)的；而生物安全柜同時(shí)提供

對(duì)操作者、環(huán)境和樣品的保護(hù)。生物安全柜可分為一級(jí)、二

級(jí)和三級(jí)三大類以滿足不同的生物研究和防疫要求。

(1)一級(jí)生物安全柜可保護(hù)工作人員和環(huán)境而不保護(hù)樣品。氣流

原理和實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)櫥一樣，不同之處在于排氣口安裝有HEPA過濾

器。所有類型的生物安全柜都在排氣和進(jìn)氣口使用HEPA過濾器。

一級(jí)生物安全柜本身無風(fēng)機(jī)，依賴外接通風(fēng)管中的風(fēng)機(jī)帶動(dòng)氣流,

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由于不能保護(hù)柜內(nèi)樣品，目前已較少使用。

(2)二級(jí)生物安全柜是目前應(yīng)用最為廣泛的柜型。按照NSF49的

中的規(guī)定，二級(jí)生物安全柜依照人口氣流風(fēng)速、排氣方式和循環(huán)

方式可分為4個(gè)級(jí)別：Al,A2,Bl,B2O所有的二級(jí)生物安全柜

都可提供工作人員、環(huán)境和樣品的保護(hù)。

(3)三級(jí)生物安全柜是為4級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全等級(jí)而設(shè)計(jì)的，柜

體完全氣密，工作人員通過連接在柜體的手套進(jìn)行操作，俗稱手

套箱，試驗(yàn)品通過雙門的傳遞箱進(jìn)出安全柜以確保不受污染，適

用于高風(fēng)險(xiǎn)的生物試驗(yàn)。生物安全柜柜內(nèi)操作主要注意事項(xiàng)：

A.緩慢移動(dòng)原則：為了避免影響正常的風(fēng)路狀態(tài)，柜內(nèi)操作時(shí)手

應(yīng)該盡量平緩移動(dòng)。

B.物品平行擺放原則：為了避免物品和物品之間的交叉污染現(xiàn)象

產(chǎn)生，在柜內(nèi)擺放的物品應(yīng)該盡量呈橫向一字?jǐn)[開，避免回風(fēng)過

程中造成交叉污染。同時(shí)避免堵塞背部回風(fēng)隔柵影響正常風(fēng)路。

C.避免震動(dòng)原則：柜內(nèi)盡量避免震動(dòng)儀器(例如離心機(jī)漩渦振蕩

器等)的使用，因?yàn)檎饎?dòng)會(huì)使得積留在濾膜上的顆粒物質(zhì)抖落。

導(dǎo)致操作室內(nèi)部潔凈度降低，同時(shí)如果在前操作面平衡失敗還會(huì)

引起安全柜對(duì)操作者的污染。

D.不同樣品柜內(nèi)移動(dòng)原則：柜內(nèi)兩種及以上物品需要移動(dòng)時(shí)，一

定遵循低污染性物品向高污染性物品移動(dòng)原則，避免污染性高的物品

在移動(dòng)過程中產(chǎn)生對(duì)柜體內(nèi)部的大面積污染。

E.明火使用原則：柜內(nèi)盡量不要使用明火！因?yàn)樵诿骰鹗褂眠^程

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中產(chǎn)生的細(xì)小顆粒雜質(zhì)將被帶入濾膜區(qū)域，這些高溫雜質(zhì)會(huì)損傷濾膜。

無法避免一定需要使用的時(shí)候，宜使用低火苗的本生燈。

F、需定時(shí)檢測工作臺(tái)性能，并記錄檢測結(jié)果，根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)

整過濾器。

G、該設(shè)備應(yīng)有專人保管并記錄使用和檢修情況。

消毒知識(shí)點(diǎn)一一干熱滅菌法干熱的殺菌作用是通過脫水干

燥和大分子變性。一般細(xì)菌繁殖體，在干燥狀態(tài)下80?100℃經(jīng)1小

時(shí)可被殺死；芽胞則需160?170C,2小時(shí)才能殺滅。干熱滅菌機(jī)制

如下：①使菌體蛋白質(zhì)變性；②電解質(zhì)濃縮引起中毒。

干熱滅菌法包括：

(1)焚燒法：用火焚燒，是一種徹底的滅菌方法，僅適用于廢

棄的污染物品和有傳染性的動(dòng)物尸體等。

(2)燒灼法：微生物操作用器材可在火焰上燒灼滅菌，但在分

子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中已不主張使用。

(3)干烤法：需在干烤箱內(nèi)進(jìn)行，通電后利用高熱空氣進(jìn)行滅

菌。一般加熱160?170℃,維持2小時(shí)即可殺滅包括芽抱在內(nèi)的一

切微生物。本法滅菌物品主要限于玻璃器皿、磁器或需干燥的注射器

等。

(4)紅外線：產(chǎn)生熱效應(yīng)，但只能照到物體的表面，多用于醫(yī)

療器械的滅菌。

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消毒知識(shí)點(diǎn)一一濕熱滅菌法濕熱滅菌法是最常用的滅菌法，效

果較好。在同一溫度下濕熱殺菌效果優(yōu)于干熱，其原因有三：①濕

熱中菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固。試驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)含水量增

加，凝固所需的溫度降低；②濕熱比干熱的穿透力好，這主要是由于

水或蒸汽傳導(dǎo)熱能的效率明顯高于空氣；③蒸汽有潛熱存在。每一克

水在100C時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)可放出529卡的熱量。這種潛熱能迅

速提高被滅菌物質(zhì)的溫度。濕熱殺菌機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，主要有以下

幾點(diǎn)：①使菌體蛋白質(zhì)變性和凝固；②使細(xì)菌核酸降解；③使細(xì)菌胞

漿膜損傷。

常用的濕熱殺菌法有：

(1)煮沸法：煮沸100C5分鐘可殺死細(xì)菌的繁殖體，但一般消毒

以煮沸10分鐘為宜，殺死芽胞則需煮沸1~3小時(shí)。煮沸法主要用于

一般外科器械、注射器、膠管和食具等的消毒。若水中加入1%?2%

碳酸氫鈉，可提高沸點(diǎn)105C,既可增強(qiáng)殺菌能力，又可防止金屬器

械生銹。

(2)流動(dòng)蒸汽滅菌法：又稱常壓蒸汽消毒法，是利用一個(gè)大氣壓

下100C的水蒸汽進(jìn)行消毒，加熱15?30分鐘可殺死細(xì)菌的繁殖體，

但不保證殺死芽抱。

(3)間歇蒸汽滅菌法：是利用反復(fù)多次的流通蒸汽殺死細(xì)菌所有

繁殖體和芽胞的一種滅菌法。本法適用于耐熱物品，也適用于不耐熱

的含糖、牛奶等培養(yǎng)基。

(4)高壓蒸汽滅菌法：是滅菌效果最好、目前應(yīng)用最廣的滅菌法，

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滅菌的溫度取決于蒸汽的壓力。在一個(gè)大氣壓下,蒸汽的溫度是100℃。

如果蒸汽被限制在密閉的容器里，隨著壓力的升高，蒸汽的溫度也相

應(yīng)的升高。在103.4kPa(l.05kg/cm2)蒸汽壓力下，溫度達(dá)到121.3℃,

維持15?20分鐘，可殺滅包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有的微生物。此法

適用于高溫和不怕潮濕物品的滅菌，如普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)

器械、注射器、手術(shù)衣、敷料和橡皮手套等耐高溫、耐濕熱物品的消

毒。

(5)巴氏消毒法：常用于牛奶和酒類的消毒。此法可殺死物品中

的病原菌或一般雜菌，而不嚴(yán)重破壞物品的質(zhì)量。方法有兩種：一種

是加熱61.1?62.8℃30分鐘；另一種是71.7℃經(jīng)15?30秒，現(xiàn)廣

泛采用后法。

消毒知識(shí)點(diǎn)一一其他物理殺菌方法

(一)輻射殺菌法1.紫外線日曬是一種有效的天然殺菌方法,

其殺菌作用主要是靠日光中的紫外線。將病人的被褥、衣服、書報(bào)等

放在日光下暴曬數(shù)小時(shí)，可達(dá)到消毒之目的。一般用于消毒的人工紫

外線是由低壓水銀蒸汽燈、紫外線燈產(chǎn)生的。由于紫外線穿透力較弱，

不能透過玻璃、紙張等物品，故只適用于空氣和物品表面的消毒。紫

外線對(duì)人體皮膚和眼睛角膜有一定的損傷作用，使用紫外線燈照射時(shí)

應(yīng)注意防護(hù)。紫外線的殺菌作用與其波長有關(guān)，通常波長為240?

280nm者具有殺菌作用。其中以260nm最強(qiáng)。2.電離射線電

離射線具有較高的能量和穿透力，可直接或間接破壞微生物的核酸、

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蛋白質(zhì)和酶系統(tǒng)，從而對(duì)其產(chǎn)生致死效應(yīng)。用于消毒滅菌的電離射線

有X射線

（二）濾過除菌法濾過除菌是用特殊的器具將液體或空氣中細(xì)

菌除去的方法。所用器具是含有微細(xì)小孔的濾菌器，通常大于孔徑的

細(xì)菌不能通過，借以獲得無菌液體或空氣。主要用于不耐高溫滅菌的

血清、毒素、抗生素、藥液和空氣等的除菌，除菌濾器一般不能除去

病毒、支原體和L型細(xì)菌。濾菌器的種類很多，目前常用的有蔡

氏濾菌器、玻璃濾菌器、薄膜濾菌器。

（三）超聲波殺菌法超聲波可以裂解多數(shù)的細(xì)菌，尤其是革蘭陰

性菌更為敏感，但往往有殘存者。目前，超聲波主要用于粉碎細(xì)胞,

以提取細(xì)胞組份或制備抗原等。超聲波裂解細(xì)菌的機(jī)制主要是它通過

水時(shí)發(fā)生的空（腔）化作用，在液體中造成壓力改變。

（四）干燥與低溫抑菌法有些細(xì)菌的繁殖體在空氣中干燥時(shí)會(huì)

很快死亡，例如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、霍亂弧菌等，但有些細(xì)

菌的抗干燥力較強(qiáng)，如溶血性鏈球菌在塵埃中存活可達(dá)25天，結(jié)核

分枝桿菌在干燥的痰中可數(shù)月不死。芽胞的抵抗力更強(qiáng)，炭疽芽胞桿

菌的芽胞耐干燥可達(dá)20多年。干燥法常用于保存食物，濃鹽或糖漬

食品可使細(xì)菌體內(nèi)水分散失，造成生理性的干燥，細(xì)菌的生命活動(dòng)停

止，防止食物變質(zhì)。

低溫可使細(xì)菌的新陳代謝減慢，常用做保存細(xì)菌菌種，當(dāng)溫度回

升至適宜范圍的時(shí)候，又能恢復(fù)生長繁殖。為避免解凍時(shí)對(duì)細(xì)菌的損

傷，可在低溫狀態(tài)下真空抽去水分，此法稱為冷凍真空干燥法。

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消毒知識(shí)點(diǎn)一一化學(xué)消毒法化學(xué)消毒法是利用化學(xué)藥物殺死

或抑制病原微生物的方法。具有殺菌作用的化學(xué)藥品稱化學(xué)消毒劑;

用于抑制微生物生長繁殖的化學(xué)藥品稱防腐劑?；瘜W(xué)消毒劑不僅對(duì)細(xì)

菌有毒害作用，對(duì)人體組織細(xì)胞也有損傷作用。因此，只能外用或用

于環(huán)境的消毒。

根據(jù)化學(xué)消毒劑的殺菌機(jī)制的不同，主要分為以下幾類：

（1）促進(jìn)菌體蛋白質(zhì)變性或凝固，例如酚類（高濃度）、醇類、重金

屬鹽類（高濃度）、酸堿類、醛類；

（2）干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)和代謝，例如某些氧化劑、重金屬鹽類（低

濃度）與細(xì)菌的-SH基結(jié)合使有關(guān)酶失去活性；

（3）損傷細(xì)菌的細(xì)胞膜，例如酚類（低濃度）、表面活性劑、脂溶劑

等，能降低細(xì)菌表面張力并增加其通透性，胞外液體內(nèi)滲，致使細(xì)菌

破裂。酚類：石炭酸、來蘇、洗比泰等酚類化合物，低濃度時(shí)

破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，使胞內(nèi)容物漏出；高濃度時(shí)是菌體蛋白質(zhì)凝固。

醇類：殺菌機(jī)制在于去除細(xì)菌胞膜中的脂類，并是菌體蛋白質(zhì)變性。

乙醇最常用，濃度70%?75%時(shí)殺菌力最強(qiáng)，高濃度因能使菌體表面

蛋白質(zhì)迅速凝固，殺菌力反而降低。重金屬鹽類：高濃度時(shí)與帶

陰性電荷的菌體蛋白質(zhì)結(jié)合，使之發(fā)生變性或沉淀，也可以與細(xì)菌酶

蛋白的-SH基結(jié)合，使其喪失酶活性。氧化劑：常用的有過氧化

氫、過氧乙酸、高鋅酸鉀與鹵素等。殺菌機(jī)制依靠其氧化能力。過氧

乙酸為強(qiáng)氧化劑，對(duì)細(xì)菌的繁殖體和芽胞、真菌、病毒等都具有殺滅

25

作用，應(yīng)用廣泛，但易分解并具有刺激性和腐蝕性，不適用于金屬器

具的消毒。用于消毒的鹵素有碘和氯兩類，碘多用于皮膚的消毒，氯

多用于水的消毒。氯化合物有漂白粉、次氯酸鈣、次氯酸鈉等。表

面活性劑：常用于消毒的表面活性劑有新潔爾滅。烷化劑：殺菌

機(jī)制在于對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)和核酸的烷化作用，殺菌譜廣，殺菌力強(qiáng)。常

用的有甲醛、環(huán)氧乙烷和戊二醛等。缺點(diǎn)是有些對(duì)人體有毒性，并且

有些烷化劑可能有致癌作用。

消毒知識(shí)點(diǎn)一一影響消毒滅菌的效果因素

1.消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時(shí)間消毒劑在一定濃度下，對(duì)

細(xì)菌的作用時(shí)間越長，消毒效果越好。

2.微生物的種類與數(shù)量同一消毒劑對(duì)不同微生物的殺菌效果

不同，一般的消毒劑對(duì)結(jié)核分枝桿菌的作用要比其他細(xì)菌繁殖體作

用差；70%乙醇能殺死一般細(xì)菌繁殖體，但不能殺滅細(xì)菌的芽胞,

必需根據(jù)消毒對(duì)象選擇合適的消毒劑。此外，微生物的數(shù)量越大,

所需要的消毒的時(shí)間就越長。

3.溫度溫度升高可以提高消毒效果。

4.酸堿度消毒劑的殺菌作用受酸堿度的影響，例如戊二醛本

省呈中性，其水溶液呈弱酸性，不具有殺滅芽胞的作用。

5.有機(jī)物環(huán)境中有機(jī)物的存在可影響消毒的效果。

26

細(xì)菌檢驗(yàn)基本技術(shù)：芽胞染色、莢膜染色及鞭毛染色

1.芽胞染色用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠在加熱條件下染

色，使染料不僅進(jìn)入菌體也可以進(jìn)入芽抱內(nèi)，進(jìn)入菌體的染料經(jīng)

水洗后被脫色，而進(jìn)入芽胞一經(jīng)著色則很難被水洗脫色。當(dāng)用復(fù)

染劑染色后，芽胞仍保留初染劑的顏色，而菌體和芽胞囊被染成

復(fù)染劑的顏色，使芽胞和菌體更容易區(qū)分。芽胞染色的操

作步驟：制成菌懸液一孔雀綠染色1分鐘一將試管水浴加

熱15?20分鐘一用接種環(huán)取加熱染色菌液制成涂片一干燥一

固定f水洗脫色一蕃紅花或稀釋石炭酸復(fù)紅復(fù)染1?2分鐘一水

洗一晾干一油鏡觀察。

2.莢膜染色由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通

常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色,

從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90%

以上，故染色時(shí)一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。在莢膜染

色方法中，以負(fù)染色法和濕墨水法較為常用，其中濕墨水法較簡

便，并且適用于各種有莢膜的細(xì)菌。

3.鞭毛染色細(xì)菌的鞭毛極細(xì)，直徑一般為10?20nm,只

有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在

普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原

理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭

毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。常用鍍銀法染色。

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在顯微鏡下，主要觀察菌落結(jié)構(gòu)，表面特征和菌落邊緣的

形態(tài)等。例如炭疽芽胞桿菌菌落邊緣呈現(xiàn)大量卷曲的纖絲狀紋理,

稱為獅鬃樣菌落；鼠疫菌落表面呈現(xiàn)粗糙的顆粒狀突起，在血瓊

脂平板上生長的菌落邊緣帶有“花邊”；支原體的菌落呈現(xiàn)“荷包

蛋”狀等。

生活飲用水水質(zhì)微生物檢測樣品采集及處理知識(shí)點(diǎn)一一水樣

的采集與保存

一、水樣的采集

1.對(duì)容器的要求容器及瓶塞、瓶蓋應(yīng)能經(jīng)受滅菌的溫度，并

且在這個(gè)溫度下不釋放或產(chǎn)生任何能抑制生物活動(dòng)或?qū)е滤劳龌?/p>

促進(jìn)生長的化學(xué)物質(zhì)。玻璃或聚丙烯塑料容器用自來水和洗滌劑

洗滌，然后用自來水徹底沖洗。用硝酸溶液(1+1)浸泡，再用自

來水，蒸儲(chǔ)水洗凈。為了除去余氯，在滅菌前向容器里加

入硫代硫酸鈉以還原余氯［每125ml水樣加0.1ml硫代硫酸鈉

(100g/L)］。

2.容器滅菌熱力滅菌是最可靠而普遍應(yīng)用的方法。熱力滅菌

分干熱和高壓蒸汽滅菌兩類。聚丙烯瓶只能用高壓蒸汽滅菌，玻

璃瓶可用兩種方法滅菌。干熱滅菌之后，玻璃容器是干燥的，便

于保存和應(yīng)用；高壓蒸汽滅菌之后，應(yīng)自滅菌器中取出放在烤箱

內(nèi)烤干，干熱滅菌所需溫度較高、時(shí)間較長。高壓蒸汽滅菌法要

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求121C15分鐘，即可殺死芽胞。干熱滅菌法殺死芽胞需160℃?

180℃＞維持2小時(shí)。

3.為了除去余氯，在滅菌前向容器里加入硫代硫酸鈉以還原

余氯［每125ml水樣加0.1ml硫代硫酸鈉(100g/L)］。

4.采集自來水時(shí)應(yīng)開啟水龍頭，適當(dāng)放水?dāng)?shù)分鐘后再取樣。

二、水樣的保存方法

4℃保存，4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)。

醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水和污泥樣品的采集和處理知識(shí)點(diǎn)一一醫(yī)療機(jī)構(gòu)污泥的

采樣和樣品處理

所采集的樣品應(yīng)具有代表性，制成約500g的表層和中層的平均

混合樣品，置于無菌容器中帶回實(shí)驗(yàn)室。

污水樣品采集后應(yīng)按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)，如不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)將

樣品放置冰箱內(nèi)保存，并應(yīng)在6小時(shí)內(nèi)檢驗(yàn)。

(-)檢測糞大腸菌值時(shí)樣品的采集及處理

稱取采集的污泥樣品100g,溶解于100ml無菌生理鹽水中，充

分?jǐn)嚢杈鶆?，用無菌吸管吸取此混懸液2ml,加入發(fā)酵管中培養(yǎng)；并

將此混懸液依次稀釋后，吸取不同濃度的稀釋液按檢驗(yàn)要求接種發(fā)酵

管培養(yǎng)。

(二)檢測沙門菌和志賀菌時(shí)樣品的采集和處理

稱取采集的污泥樣品30g,放入滅菌容器內(nèi)，加入300ml無菌生

理鹽水，充分?jǐn)嚢杌靹?，制?：10混懸液，用無菌吸管吸取此混懸

29

液100ml加入相應(yīng)增菌液中培養(yǎng)。

（三）檢測結(jié)核桿菌時(shí)樣品的采集和處理

稱取采集的污泥樣品10g,放入滅菌容器內(nèi)，加入100ml無菌水

沖洗過濾（濾紙漏斗），再經(jīng)玻璃漏斗G2（孔徑10?15P.m）和G4

（孔徑3?4p.m）抽濾，最后再經(jīng)濾膜（孔徑0.45-0.7觸）抽濾。

取下濾膜，用4%硫酸3ml,充分振蕩沖洗30分鐘。取上述酸性溶液

各0.1ml,分別接種培養(yǎng)。

（四）檢測蛔蟲卵時(shí)樣品的采集和處理

采集回的樣品應(yīng)立即檢驗(yàn),如不能立即檢驗(yàn)應(yīng)加入5~10ml3%

或5%甲醛或3%鹽酸溶液，用平皿蓋住廣口瓶瓶口，然后放于冰箱

內(nèi)，以防止微生物繁殖和蛔蟲卵的發(fā)育。

醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水和污泥樣品的采集和處理知識(shí)點(diǎn)一一醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水的

采樣和樣品處理

所采集的樣品應(yīng)具有代表性，采集后應(yīng)立即登記，編寫檢驗(yàn)序號(hào),

并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)，如不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)將樣品放置冰箱內(nèi)保存,

并應(yīng)在6小時(shí)內(nèi)檢驗(yàn)。

（-）檢測總余氯指標(biāo)時(shí)樣品的采集及處理

1.所檢測樣品需在醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水最終排放口處用沖洗干凈的玻

璃容器采集。

2.采樣后應(yīng)立即檢測，避免強(qiáng)光、振蕩及溫?zé)岬纫蛩氐挠?/p>

響。

30

為避免污水中懸浮性固體對(duì)檢測結(jié)果的影響，可用離心機(jī)離心分

離，棄去懸浮物沉淀。

3.被測樣品的溫度應(yīng)在15℃?20℃。如低于此溫度，應(yīng)先將盛

樣品的玻璃容器放入溫水中，使其溫度升至要求溫度后，再測定數(shù)

值。

（二）檢測糞大腸菌群時(shí)樣品的采集及處理

1.用采水器或其他無菌容器采取污水樣1000ml,放入滅菌瓶內(nèi)

（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5%硫代硫酸鈉溶液5ml中和余

氯）。

2.采集好的水樣應(yīng)立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，一般不宜超過2小時(shí)，

否則應(yīng)在10℃下保存樣品，但需在6小時(shí)內(nèi)檢測。

（三）檢測沙門菌和志賀菌時(shí)樣品的采集和處理

1.用采水器或其他無菌容器采取污水樣1000ml,放入滅菌瓶內(nèi)

（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5%硫代硫酸鈉溶液5ml中和余

氯）。

2.采集好的水樣應(yīng)立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，一般不宜超過2小時(shí)，

否則應(yīng)在10℃下保存樣品，但需在6小時(shí)內(nèi)檢測。

3.取污水250ml,用無菌紗布或脫脂棉進(jìn)行初濾，然后用濾膜

進(jìn)行抽濾，將初濾后的紗布或脫脂棉和濾膜，放入相應(yīng)的增菌液中進(jìn)

行增菌培養(yǎng)。

（四）檢測結(jié)核桿菌時(shí)樣品的采集和處理

1.用采水器或其他無菌容器采取污水樣1000ml。放入滅菌瓶內(nèi)

31

（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5%硫代硫酸鈉溶液5ml中和余

氯）。

2.采集好的水樣應(yīng)立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，一般不宜超過2小時(shí)，

否則應(yīng)在10℃下保存樣品，但需在6小時(shí)內(nèi)檢測。

3.根據(jù)檢驗(yàn)條件，可選用濾膜集菌法和離心集菌法進(jìn)行集菌，

然后進(jìn)行接種和培養(yǎng)。

（1）濾膜集菌法：采用經(jīng)煮沸消毒的醋酸纖維膜（孔徑0.3?

0.7觸）和特制的金屬濾器，抽濾500ml污水，根據(jù)懸浮物的多少，

一份水樣要更換數(shù)張濾膜，將同一份水樣的濾膜集中于小燒杯中，用

4%硫酸溶液反復(fù)沖洗，靜置30分鐘，收集洗液于離心管中，3000

轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，棄去上清液。沉淀物中加1ml滅菌生理鹽水

混合均勻后，供接種用。

（2）離心集菌法：將水樣500raL分裝于50ml或200ml滅菌離心

管中，3000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，同一份水樣的沉淀物集中于試管

中，加等量4%硫酸處理30分鐘，供接種用。如體積過大，再次離

心濃縮后接種。化妝品微生物檢測樣品采集及處理知識(shí)點(diǎn)一一樣品

的采集及注意事項(xiàng)1.所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視

每批化妝品數(shù)量大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分

別從2個(gè)包裝單位以上的樣品中共取10g或10ml。包裝量小于20g

的樣品，采樣量可以適當(dāng)增加，其總量應(yīng)大于16go2.供檢

驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。進(jìn)口產(chǎn)品應(yīng)為市售包裝。容器

不應(yīng)有破裂，在檢驗(yàn)前不得打開，防止樣品被污染。3.接到

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樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不

能及時(shí)檢驗(yàn)，樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。

4.若只有1個(gè)樣品而同時(shí)需作多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，

應(yīng)先作微生物檢驗(yàn)，再將剩余樣品作其他分析。5.在檢驗(yàn)過

程中，從打開包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均需防止微生物的再污染和

擴(kuò)散，所用采樣用具、器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌

室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無菌操作規(guī)定進(jìn)行。

化妝品微生物檢測樣品采集及處理知識(shí)點(diǎn)一一供檢樣品的制備

（-）液體樣品1.水溶性的液體樣品，可量取10ml加到90ml

滅菌生理鹽水中，如樣品少于10mL仍按10倍稀釋法進(jìn)行。如為5ml

則加到45m滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1：10檢液。2.油

性液體樣品，取樣品10ml,先加5ml滅菌液狀石蠟混勻，再加10ml

滅菌的吐溫-80,在40?44℃水浴中振蕩混合10分鐘，加入滅菌的

生理鹽水75ml（在40℃?44c水浴中預(yù)溫），在40℃?44c水浴中

乳化，制成1：10的懸液。

（二）膏、霜、乳劑半固體狀樣品1.親水性的樣品。稱取10g,

加到裝有玻璃珠及90ml滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻。

靜置15分鐘。用其上清液作為1：10檢液。2.疏水性樣品,

稱取10g,放到滅菌的研缽中，加10ml滅菌液狀石蠟，研磨成黏稠

狀，再加入10ml滅菌吐溫80,研磨待溶解后。加70ml滅菌生理鹽

水，在40℃?44c水浴中充分混合，制成1：10檢液。

33

（三）固體樣品稱取10g,加到90ml滅菌生理鹽水中，充分

振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1：10檢液。

如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等.可稱10g樣品加入

90ml滅菌生理鹽水，均質(zhì)1?2分鐘；疏水性膏、霜及眉筆、唇膏等，

稱10g樣品，加10ml滅菌液狀石蠟，10ml滅菌吐溫-80,70ml滅菌

生理鹽水，均質(zhì)3?5分鐘。

公共場所樣品采集方法及處理知識(shí)點(diǎn)一一空氣微生物樣品采集及處

理

（一）撞擊法

1.選擇有代表性的位置設(shè)置采樣點(diǎn)。將采樣器消毒，按儀器使

用說明進(jìn)行采樣。

2.樣品采完后，將帶菌營養(yǎng)瓊脂平板置36℃±1℃恒溫箱中，

培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，并根據(jù)采樣器的流量和采樣時(shí)間，換算

成每立方米空氣中的菌落數(shù)。以cfu/m3報(bào)告結(jié)果。

3.選擇撞擊式空氣微生物采樣器的基本要求

（1）對(duì)空氣中細(xì)菌捕獲率達(dá)95%。

（2）操作簡單，攜帶方便，性能穩(wěn)定，便于消毒。

（二）自然沉降法

1.設(shè)置采樣點(diǎn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)現(xiàn)場的大小，選擇有代表性的位置作

為空氣細(xì)菌檢測的采樣點(diǎn)。通常設(shè)置5個(gè)采樣點(diǎn)，即室內(nèi)墻角對(duì)角線

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交點(diǎn)為1個(gè)采樣點(diǎn)，該交點(diǎn)與四墻角連線的中點(diǎn)為另外4個(gè)采樣點(diǎn)。

采樣高度為1.2?1.5m。采樣點(diǎn)應(yīng)遠(yuǎn)離墻壁1m以上，并避開空調(diào)、

門窗等空氣流通處。

2.將營養(yǎng)瓊脂平板置于采樣點(diǎn)處，打開平皿蓋，暴露5分鐘，

蓋上平皿蓋，翻轉(zhuǎn)平板，置36℃±1℃恒溫箱中，培養(yǎng)48小時(shí)。

3.計(jì)數(shù)每塊平板上生長的菌落數(shù)，求出全部采樣點(diǎn)的平均菌落

數(shù)。以cfu/皿報(bào)告結(jié)果。

（一）細(xì)菌總數(shù)測定

1.隨機(jī)抽取清洗消毒后準(zhǔn)備使用的茶具。

2.用滅菌生理鹽水濕潤棉拭子，在茶具內(nèi)、外緣，涂抹50cm2,

即1?1.5cm高處一圈（口唇接觸處）。用滅菌剪刀剪去棉簽手接觸的

部位，將棉拭子放人10ml生理鹽水內(nèi)，4小時(shí)內(nèi)送檢。

3.將放有棉拭子的試管充分振搖。