電化學發(fā)光免疫分析法

電化學發(fā)光免疫分析法Electro-ChemiluminescenceImmunoassay(ECLI)主講人崔天根

電化學發(fā)光免疫分析法

Electro-ChemiluminescenceImmunoassay(ECLI)免疫分析法發(fā)光和化學發(fā)光化學發(fā)光免疫分析法電化學發(fā)光電化學發(fā)光免疫分析法免疫分析法它是基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種技術手段?？乖贵w反應是指抗原與相應的抗體之間發(fā)生的特異性反應，它既可以發(fā)生在體內，也可以發(fā)生在體外。免疫標記技術是將一些既容易測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統(tǒng)中抗原或抗體的性質或含量。免疫學檢測的發(fā)展階段免疫學檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學發(fā)光物質等對檢測信號進行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質、激素等微量物質。我國免疫學的檢測基本歷經了以下幾個過程:中國免疫學檢測的歷史演進放射免疫檢測：興于20世紀70年代，現在已經基本淘汰，可能有些小醫(yī)院還在使用。酶聯免疫檢測：興于20世紀80年代，現普遍使用于各級臨床機構，為我國臨床免疫診斷的基本方法。以化學發(fā)光為代表的光生物學標記及免疫檢測技術，始于20世紀90年代，現廣泛應用于縣級以上各醫(yī)療機構，產品已經步入成熟期。按示蹤物及標記種類分放射免疫技術熒光免疫技術酶免疫技術化學發(fā)光免疫技術金免疫技術勻相免疫測定非勻相免疫測定按示蹤物及標記種類分按測定物反應體系的物理狀態(tài)分免疫分析檢測的技術分類發(fā)光的分類光照發(fā)光：發(fā)光劑經短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。生物發(fā)光：反應底物在熒光素酶的催化下利用ATP產能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復到基態(tài)時多余的能量以光子的形式放出。化學發(fā)光：在常溫下由化學反應產生的光的發(fā)射，化學發(fā)光是一個多步驟的過程。在自然界有各種各樣的發(fā)光現象發(fā)光螢火蟲螢火蟲發(fā)光深海魚發(fā)光化學發(fā)光

Chemiluminescence

（CL）化學發(fā)光是指在某些特殊的化學反應中，反應的中間體或產物由于吸收了反應釋放的化學能而處于電子激發(fā)態(tài)，當其回到基態(tài)時伴隨產生的光輻射現象。化學發(fā)光反應包括兩個關鍵的步驟：化學激發(fā)和發(fā)光化學發(fā)光分析----根據化學發(fā)光反應在某一時刻的發(fā)光強度或反應的發(fā)光總量來確定反應中相應組分含量的分析方法，成為化學發(fā)光分析?；瘜W發(fā)光免疫分析----是集靈敏的化學發(fā)光技術和特異的抗原抗體免疫測定于一體的檢測技術?；瘜W發(fā)光免疫分析的特點：靈敏度高、特異性高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動化。

化學發(fā)光免疫分析Chemiluminescenceimmunoassay(CLIA)化學發(fā)光免疫技術的類型

按發(fā)光劑不同分為發(fā)光酶免疫測定（Chemiluminescenceenzymeimmunpassay

CLEIA）化學發(fā)光免疫測定技術（ChemiluminescenceimmunoassayCLIA）電化學發(fā)光免疫測定技術（ElectrocheminluminescenceimmunoassayECLI）按分離方法不同分微離子化學發(fā)光免疫測定磁顆粒化學發(fā)光免疫測定

化學發(fā)光劑機制

某些化合物可以利用化學反應產生能量使其產物分子或反應中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)，當此產物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）?；瘜W發(fā)光劑或發(fā)光底物

在化學發(fā)光反應中參與能量轉移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑和化學發(fā)光劑。化學發(fā)光劑應符合以下幾個條件能參與化學反應；與抗原或抗體偶聯后成穩(wěn)定的結合物試劑；偶聯后仍保留高的量子效應和反應動力；應不改變或極少改變被標記物的理化特性，特別是免疫活性。魯米諾1,酶促反應的發(fā)光底物是指經酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發(fā)光底物有魯米諾、對一羥基苯乙酸AP的發(fā)光底物有AMPPD、4—MUP（熒光底物）特點：可做標記物，也可以做過氧化物酶的底物酶促反應的發(fā)光底物1.魯米諾HPA在H2O2存在下被ＨPR氧化成氧化二聚體（熒光物質），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光，可用熒光光度計計量。對一羥基苯乙酸（HPA）原理屬于酶免疫測定的一種，只是最后一步酶反應所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。技術類型根據酶促反應所用底物不同可分為：

1熒光酶免疫測定技術

2化學發(fā)光酶免疫測定技術根據免疫學反應模式分

1雙抗體夾心法和雙抗原夾心法

2固相抗原競爭法一，發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）化學發(fā)光酶免疫測定技術反應原理圖抗原抗體結合反應將已包被了抗體的乳膠顆粒和待測標本加入反應杯中，經溫育一定時間后，再加入AP標記抗體，溫育，形成固相包被抗原—抗體—酶標記復合物。分離技術將復合物轉移到玻璃纖維上，用緩沖液洗滌，沒結合的抗原被洗脫，酶標抗體-抗原-膠乳微?？贵w復合物被保留在纖維膜上。酶促發(fā)光反應加入4-MUP，酶標抗體上的AP將4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發(fā)光照射下發(fā)出448nm的熒光，經光記錄儀放大處理計算出待測物質的含量。發(fā)光酶免疫測定技術的技術要點分離技術磁顆粒分離法

原理為血清樣品與標準品中的抗原或抗體與磁顆粒上的一定量的抗體或抗原反應，產生的抗原抗體磁性顆粒復合物，在磁場作用下沉降，使結合部分與游離部分分離。

微粒子捕獲法

采用無磁性的微粒子作為抗原抗體的包被載體，然后用纖維膜柱子進行酶標記物的結合和游離狀態(tài)的分離。包被珠分離法

用聚苯乙烯等材料制成用作包被抗原抗體的小珠，經抗原抗體反應后，將結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標記物分離。二.化學發(fā)光免疫測定技術(ELIA)原理用發(fā)光劑直接標記抗原或抗體，與待測樣本中相應的抗體或抗原、磁性顆粒上的抗原或抗體反應，通過磁場把結合狀態(tài)（沉淀部分）和游離狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來，然后加入發(fā)光促進劑進行發(fā)光發(fā)應。技術類型

1分離方法常用磁顆粒分離技術

2免疫學反應模式同酶發(fā)光免疫測定技術，不同的只是相應的標記物是吖啶脂而不是酶。直徑2.8微米磁性微粒子固相親和素—生物素親和素—生物素三,電化學發(fā)光免疫測定技術(CLIA)電化學發(fā)光(ECL)

原理是指在電極上施加一定波形的電壓或電流信號,進行電解反應的產物之間或與體系中共存組分反應產生化學發(fā)光的現象.它包含了電化學和化學發(fā)光兩個過程.

ECL和CL的區(qū)別在于:ECL是電啟動發(fā)光反應,而CL是通過化合物混合啟動發(fā)光反應,因此ECL反應便于精確控制,具有靈活性.電化學發(fā)光劑ECL分析中采用三聯吡啶釕作為標記物，其活化衍生物是三聯吡啶釕+N羥基琥珀酸胺脂（NHS），該衍生物具有水溶性，且高度穩(wěn)定，保證電化學發(fā)光反應的高效和穩(wěn)定，而且避免了本底噪聲的干擾。三聯吡啶釕衍生物與免疫球蛋白結合的分子比超過20仍不會影響抗體的可溶性和免疫活性。三聯吡啶釕衍生物分子量小，空間位阻小，即便是小分子的核酸也能標記，使檢測的菜單大大豐富，有更為廣闊的開發(fā)前景。三聯吡啶釕的特點電化學發(fā)光標記物---

三聯吡啶釕

N羥基琥珀酰胺(NHS)酯光子620nm電化學發(fā)光（ECL）檢測的技術原理二價的三聯吡啶釕在電場的作用下，失去一個電子氧化成三價的三聯吡啶釕同時，在電場的作用下，三丙胺也失去一個電子被氧化,然后脫氫成三丙胺自由基三丙胺自由基傳遞一個電子給三價的三聯吡啶釕使之進入激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)的三聯吡啶釕不穩(wěn)定,以發(fā)射一個波長為620nm的光子的形式釋放能量而回到基態(tài)三聯吡啶釕不被消耗,即發(fā)光標記物可循環(huán)發(fā)光CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3CH2CH2CH3CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3+e-CH2CH2CH3CH3CH2CH2-N-C-CH2CH3CH2CH2CH3+H+CH3CH2CH2-N-HCH2CH2CH3+CH3CH2CHO氧化電極.

+.

.H氧化Ru(bpy)33+Ru(bpy)32++Ru(bpy)32+還原三丙胺(tripropylamine,TPA)ECL的測定模式ECL的優(yōu)勢注:試劑表現不僅僅表現在靈敏度和寬線性,還有特異性,重現性,線性回歸,攜帶率,準確性和臨床符合性等多種表現靈敏度高(10-12~10-18)，可達Pg/ml或Pmol水平重復性好

CV＜5.0%檢測線性寬(7個數量級)試劑穩(wěn)定，無污染，有效期長操作簡單，易于自動化ECL的臨床應用肝炎乙肝表面抗原乙肝表面抗體乙肝核心抗體乙肝核心抗體M乙肝e抗原乙肝e抗體甲狀腺功能三碘甲狀腺原氨酸甲狀腺素游離三碘甲狀腺原氨酸游離甲狀腺素超敏促甲狀腺素甲狀腺攝取甲狀腺球蛋白抗-TPO抗-Tg腫瘤標志物甲胎蛋白