第三章 基因工程的載體課件

第三章基因工程的載體

基因工程三大技術(shù)發(fā)明之一1946年Lederberg開始研究細(xì)菌的性因子——F因子；一類通過細(xì)胞間接觸而引起自身DNA轉(zhuǎn)移的接合性質(zhì)粒，它能決定所在細(xì)菌的性別。性質(zhì)粒也稱性因子、致育因子(fertilityfactor)或F因子。

50-60年代其它質(zhì)粒的相繼發(fā)現(xiàn)：抗藥因子(R因子)、大腸桿菌素因子(coE)等。概述第三章-基因工程的載體基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到擴(kuò)增或表達(dá)，而目的基因本身無法進(jìn)行復(fù)制，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細(xì)胞”來實(shí)現(xiàn)。載體（vector）:是指在基因工程中攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的“運(yùn)載工具”。其本質(zhì)是DNA。第三章-基因工程的載體第三章-基因工程的載體根據(jù)來源和性質(zhì)劃分：質(zhì)粒載體噬菌體載體粘粒載體人工染色體載體（酵母、細(xì)菌）噬菌粒載體病毒第三章-基因工程的載體根據(jù)受體細(xì)胞不同劃分：原核生物載體真核生物載體大腸桿菌載體酵母載體植物基因工程載體動(dòng)物基因工程載體第三章-基因工程的載體根據(jù)功能和用途劃分：克隆載體（繁殖目的基因或DNA片斷）表達(dá)載體（用于基因的蛋白表達(dá)）轉(zhuǎn)化載體（用于基因轉(zhuǎn)化）測(cè)序載體（用于基因的測(cè)序）穿梭載體（在不同的細(xì)胞中穿梭）整合載體（把一個(gè)基因插入到染色體組中）第三章-基因工程的載體運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的表達(dá)提供必要的條件載體的功能第三章-基因工程的載體自身分子量較小，在寄主細(xì)胞中的拷貝數(shù)高，易于操作和DNA的制備。

能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立、高效穩(wěn)定的自我復(fù)制。要有合適的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別、切割位點(diǎn)。但限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)最好是單一的，且不在DNA復(fù)制的必需區(qū)；具有較高的DNA裝載能力。具有1-2個(gè)選擇標(biāo)記基因，如對(duì)抗生素的抗性基因等，易于后期重組子的選擇。有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。載體應(yīng)具備的條件第三章-基因工程的載體載體的一般結(jié)構(gòu)特征多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記pUCMCSAmprMultiplecloningsite（多克隆位點(diǎn)）第三章-基因工程的載體Multiplecloningsite第三章-基因工程的載體第一節(jié)質(zhì)粒載體質(zhì)粒是一種廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞染色體以外的（獨(dú)立的）能自主復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡(jiǎn)單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對(duì)細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。第三章-基因工程的載體一.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性（1）質(zhì)粒的大小

差異很大，最小的只有1kb，只能編碼中等大小的2-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到200kb。（2）質(zhì)粒的生存

在寄主細(xì)胞中“友好”地“借居”，離開了寄主它本身無法復(fù)制，它可以賦予寄主一些非染色體控制的遺傳性狀，以利于寄主的生存。第三章-基因工程的載體（3）質(zhì)粒的復(fù)制類型一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒（stigentplasmid）,拷貝數(shù)為1-3；“松弛型”質(zhì)粒（relaxedplasmid）,拷貝數(shù)為10-60。不過，即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間也可能有很大的變化。

應(yīng)用：克??？？？表達(dá)？？？？第三章-基因工程的載體（4）質(zhì)粒的不親和性

在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。已鑒別出30個(gè)以上大腸桿菌質(zhì)粒的不親和群，它們之間是不相容的。Why不親和？有什么意義？？？第三章-基因工程的載體（5）質(zhì)粒的存在形式

有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種。雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）（ccDNA）開環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）（ocDNA）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）（lDNA）裂口第三章-基因工程的載體LOCSC原因未知第三章-基因工程的載體（6）作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備復(fù)制的起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點(diǎn)區(qū)等部分。第三章-基因工程的載體多克隆位點(diǎn)：克隆載體中的一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成，而且每個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)應(yīng)該在整個(gè)載體中是唯一的。選擇標(biāo)記基因：用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如對(duì)氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。這樣，通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以選擇得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（菌）。第三章-基因工程的載體二.質(zhì)粒的命名規(guī)則天然質(zhì)粒：第一個(gè)字母大寫如F質(zhì)粒、R質(zhì)粒、Col(colicins)質(zhì)粒等。重組質(zhì)粒：通常小寫字母p，后加兩個(gè)大寫字母表示。如pBR322

人名或研究機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室編號(hào)p：plasmid；SC：StanleyCohn；MT：麻省理工學(xué)院；BR：F.Bolivar和R.L.Rodriguez含有目的基因的質(zhì)粒命名？？？第三章-基因工程的載體三.質(zhì)粒載體的構(gòu)建及改造天然質(zhì)粒用作載體的局限性局限性：分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位點(diǎn)少、選擇標(biāo)記不適合。第三章-基因工程的載體改造通常包括如下幾個(gè)方面●去掉不必要的DNA區(qū)域，保留復(fù)制子等必要部分，盡量縮小質(zhì)粒分子量，以提高外源DNA片段的裝載量。●減少限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)?！窦尤胍子跈z測(cè)的選擇性標(biāo)記（標(biāo)記基因）?！耜P(guān)于質(zhì)粒的安全性改造，保證質(zhì)粒載體不隨便轉(zhuǎn)移。（避免濫交質(zhì)粒）●改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。第三章-基因工程的載體標(biāo)記基因標(biāo)記基因按其用途分為2類：選擇標(biāo)記基因:用于鑒別目的載體的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。篩選標(biāo)記基因:用于區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，可將攜帶了外源DNA片段的重組質(zhì)粒挑選出來。第三章-基因工程的載體1.選擇標(biāo)記基因第三章-基因工程的載體2.篩選標(biāo)記基因(1)LacZ的α-互補(bǔ)(α-complementation)

是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的操縱基因區(qū)段的LacZ基因的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，從而產(chǎn)生具有β-半乳糖苷酶學(xué)活性的蛋白，這種現(xiàn)象就稱為α-互補(bǔ)。第三章-基因工程的載體

-互補(bǔ)

大腸桿菌

-半乳糖苷酶（

-片段和-片段）可以和其底物X-Gal相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的

-片段和-片段分開時(shí)就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶-片段的LacZ基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)的側(cè)翼序列中，而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的片段。這樣一來，含有功能性完整的LacZ

基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時(shí)，載體編碼的

-片段就能和寄主編碼的片段發(fā)生互補(bǔ)并具有了對(duì)底物X-Gal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被稱為alpha-complementation.第三章-基因工程的載體第三章-基因工程的載體

第三章-基因工程的載體2.篩選標(biāo)記基因

(2)插入失活(insertionalinactivation)

在質(zhì)粒pBR322的抗四環(huán)素基因上插入一個(gè)外源基因后，導(dǎo)致抗四環(huán)素基因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性，這樣就可通過對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源基因片段插入到載體中，這種篩選方法稱為插入失活。

第三章-基因工程的載體Example

在pBR322質(zhì)粒的BamHⅠ或SalⅠ位點(diǎn)插入外源DNA片斷，切斷了tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使其抗性失去活性，產(chǎn)生出AmprTets表型的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入AmpsTets的大腸桿菌細(xì)胞后，先涂布在含Amp的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Ampr菌落，再將它們影印到含Tet的選擇性培養(yǎng)基上，不能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，即為插入外源片斷的重組質(zhì)粒。（兩步完成）第三章-基因工程的載體質(zhì)粒大小對(duì)載體特性的影響質(zhì)粒越小，克隆容量越大；質(zhì)粒越大，其限制性酶切圖譜鑒定困難；質(zhì)粒越大，其拷貝數(shù)越低；質(zhì)粒越大，其雜交檢測(cè)信號(hào)越低；第三章-基因工程的載體人工構(gòu)建的質(zhì)?？煞殖扇缦聨最惛呖截愘|(zhì)粒

突變拷貝數(shù)控制基因,拷貝數(shù)1000-3000,擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒

來自pSC101,拷貝數(shù)小于10,表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒

在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測(cè)序質(zhì)粒

含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭整合質(zhì)粒

裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn),便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒

裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子,便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒

裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒

裝有報(bào)告基因,便于啟動(dòng)子等元件的篩選及鑒定第三章-基因工程的載體

探針質(zhì)粒例：克隆并驗(yàn)證某基因啟動(dòng)子基因啟動(dòng)子GFP啟動(dòng)子探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化觀察GFP表達(dá)情況第三章-基因工程的載體目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)基礎(chǔ)質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC1018.8kb，拷貝數(shù)5，含四環(huán)素抗性標(biāo)記基因Tcr;ColE16.5kb，拷貝數(shù)20-30，含大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1;pSF2124

ColE1衍生質(zhì)粒，含氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr;第三章-基因工程的載體常用（人工改造）質(zhì)粒載體

pBR322,thisisoneoftheearliestgeneralpurposecloningvectorstobedeveloped.Itisa4363bpplasmidwithtwoantibioticresistancegenes,forampicillinandtetracycline.Thereareseveraluniquerestrictionsites.pBR322generallydoesnotgivesuchahighyieldofplasmidDNAasmodernvectorssuchaspUC,pGEM，pMD，andpBluescript。（一）pBR322質(zhì)粒載體（原始載體）第三章-基因工程的載體

第三章-基因工程的載體

自學(xué)：pBR322的構(gòu)建過程！第三章-基因工程的載體pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：

1、具有較小的分子量

它的分子量為4363bp,克隆外源DNA的分子量大小不超過10kb。

2、具有兩種抗生素抗性基因

pBR322DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶的單一酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr

基因的失活；另外有3種限制酶在Ampr基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)。第三章-基因工程的載體（二）pUC質(zhì)粒載體（克隆載體）ThepUCseriesofsmall(2.7kb)plasmidscontaintheoriginofreplicationandampicillinresistancegenefrompBR322andtheE.coli

lacZgeneandmorecloningsitesonit.第三章-基因工程的載體一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分：

1、來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；2、氨芐青霉素抗性基因（Ampr

），但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的限制核酸內(nèi)切酶的單識(shí)別位點(diǎn)。

3、大腸桿菌β-半乳糖基因（lacZ）的啟動(dòng)子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ’基因；

4、位于lacZ基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。用于篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞用于篩選含有目的基因的細(xì)胞插入目的基因第三章-基因工程的載體第三章-基因工程的載體pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第一.具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù)

平均每個(gè)細(xì)胞500-700個(gè)拷貝(甚至高達(dá)3000)。第二.適用于組織化學(xué)檢測(cè)重組體

具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補(bǔ)作用，用X-Gal顯色對(duì)重組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。第三.具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段

方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。第三章-基因工程的載體（三）pGEM-3Z（克隆+表達(dá)）Italsohastwobacteriophagepromoters,SP6andT7inflankingthepolylinker.ThisallowstranscriptionofinsertstoproduceeithersenseorantisenseRNA.5’3’3’5’pGEM-3ZcontainstheLacZgeneandallowsalphacomplementation.Thevectoris2.9kbinsize,ampicillinselectableandcanbegrowntohighcopynumber.

第三章-基因工程的載體（四）pETvectors（表達(dá)載體）pETvectorsaredesignedtoallowtheexpressionofclonedgenestoproteins.pET-5hasaregionencodinganelevenaminoacidstretchofproteinbeforeEcoRIandBamHIrestrictionsites.Cloningintothesesitesresultsinexpressionoftheclonedinsertasafusionprotein.

UseofNdeIenzymeincuttingvectorandinsertallowsexistedcodontobereplacedbytheinitiationcodonoftheinsert,resultinginexpressionoftheinsertwithnofusionprotein.

第三章-基因工程的載體（五）Tvectors（PCR克隆載體）

pMD18-TVector、pMD19-TVector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物

(TACloning)的專用載體。這兩種載體分別由pUC18、pUC19載體改建而成，在pUC18、pUC19載體的多克隆位點(diǎn)處的XbaI和SalI識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoRV識(shí)別位點(diǎn)，用EcoRV進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3‘端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個(gè)"A"

的特性，所以使用這兩種制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。第三章-基因工程的載體第三章-基因工程的載體

由于這兩種載體是分別以pUC18、pUC19載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，所以它具有同pUC18、pUC19載體相同的功能。此外，這兩種制品中的高效連接液LigationMix可以在極短時(shí)間內(nèi)(約5分鐘)完成連接反應(yīng),且此連接液可以直接用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化，大大方便了實(shí)驗(yàn)操作。

pMD19-TVector與pMD18-TVector相比，pMD19-TVector的β-半乳糖苷酶的表達(dá)活性更高，菌落顯示藍(lán)色的時(shí)間縮短，菌落顯示的藍(lán)色更深。因此，克隆后更容易進(jìn)行克隆體的藍(lán)白篩選。T載體的優(yōu)點(diǎn)：第三章-基因工程的載體第二節(jié)噬菌體載體噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。第三章-基因工程的載體1.

噬菌體的生物學(xué)特性

噬菌體的生長(zhǎng)周期可分為溶菌周期和溶源周期兩種類型。前者指噬菌體將DNA注入寄主細(xì)胞后環(huán)化，然后自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。后者指噬菌體將DNA注入寄主細(xì)胞后，噬菌體DNA整合到寄主細(xì)胞染色體上并隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。只有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體被稱為烈性噬菌體。有溶源周期的噬菌體被稱為溫和噬菌體。一.噬菌體及其載體第三章-基因工程的載體1.

噬菌體的生物學(xué)特性

Lyticcycle(溶菌周期)ofgrowth:TheinjectedDNAinhostbacteriumreplicatedmanytimes,phagestructuralproteinsareexpressedandthenewphagechromosomesarepackagedintophageheads.Newphagesarethenreleasedbylysis(溶胞)ofthehostcell.第三章-基因工程的載體烈性噬菌體溶菌生長(zhǎng)的基本過程1、吸附吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌體DNA穿過細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞3、轉(zhuǎn)變被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所4、合成大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)5、組裝包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6、釋放合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來第三章-基因工程的載體噬菌體屬于溫和噬菌體，-DNA注入寄主內(nèi)，先進(jìn)入溶源周期，受某些外界條件刺激及進(jìn)入溶菌周期。1.

噬菌體的生物學(xué)特性第三章-基因工程的載體2.

噬菌體載體?λ噬菌體載體為線狀雙鏈DNA，溫和噬菌體，長(zhǎng)度約48.5kb。

?

λ噬菌體線狀雙鏈DNA分子的末端各有一個(gè)互補(bǔ)的長(zhǎng)為12bp的5`端粘性末端(cohensiveendsite)。第三章-基因工程的載體λ噬菌體整個(gè)基因組分3部分:①左臂：從A到J長(zhǎng)約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。②中段：長(zhǎng)約20kb,是λDNA整合和切出,溶原生長(zhǎng)所需序列。③右臂：長(zhǎng)約10kb,是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長(zhǎng)最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。

左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來說，中段是非必需的。第三章-基因工程的載體λ噬菌體的分子結(jié)構(gòu)第三章-基因工程的載體λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)控制噬菌體從溶源到溶菌狀態(tài)轉(zhuǎn)變第三章-基因工程的載體?cos位點(diǎn)：當(dāng)λ噬菌體進(jìn)入寄主細(xì)胞后，粘性末端通過堿基互補(bǔ)作用，形成環(huán)狀DNA分子，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。第三章-基因工程的載體

5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGCGACCTCG-3’5’-CGGC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephage

cosendsCircularformLinearform第三章-基因工程的載體cosshort(right)armcosDNAProteincoatNonessentialregionLong(left)armExogenousDNA（外源DNA）(~20-23kb)λphage12bp第三章-基因工程的載體3.

噬菌體載體的構(gòu)建3.1縮短長(zhǎng)度野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。第三章-基因工程的載體3.2刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的λ-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)；同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)；除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)。第三章-基因工程的載體3.3加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型λ-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是λ-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容。

λ-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記第三章-基因工程的載體(1)加裝選擇標(biāo)記imm434第三章-基因工程的載體(2)加裝選擇標(biāo)記lacZ第三章-基因工程的載體3.4構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型λ-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種λ-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。第三章-基因工程的載體3.5λ-DNA重組分子的體外包裝

λ-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了λ噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，只有這兩部分包裝蛋白與重組λ-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組λ-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。第三章-基因工程的載體4.λ-DNA載體的主要類型插入型載體（insertionvector）:通過特定的酶切位點(diǎn)允許外源DNA片段插入的載體。Charon2、Charon6、λgt11置換型載體(replacementvector,又稱取代型載體):允許外源DNA片段替換非必需DNA片段的載體。λEMBL4、Λgem-11、Charon40第三章-基因工程的載體第三章-基因工程的載體插入式載體：

cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶源化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。cI+cI-LysogeniccycleLyticcycleclearplaquescloudyplaquesgene第三章-基因工程的載體LacZ’基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lacZ’基因，在lacZ’基因上有EcoRI位點(diǎn)，插入失活后利用X-Gal法篩選（蘭白斑篩選）。第三章-基因工程的載體第三章-基因工程的載體取代型載體外源DNA取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段(~25kb)高感染效率(109

轉(zhuǎn)化株/ug載體DNA,比質(zhì)粒高100倍)第三章-基因工程的載體例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等載體，這些載體是用LacZ替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時(shí)將LacZ作為選擇標(biāo)記，使用時(shí)用EcoRI等水解，去掉中間的片段，再與克隆片段在體外進(jìn)行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。取代型λ噬菌體是使用最廣泛的載體。取代型載體利用LacZ反向篩選第三章-基因工程的載體取代型載體克隆外源DNA的步驟1.應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化λ載體，除去可取代的DNA片段；2.將上述所得的λDNA載體臂同外源DNA片段的連接；3.對(duì)重組體的λDNA分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體。第三章-基因工程的載體5.λ-DNA載體的優(yōu)點(diǎn)λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌；λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量；重組λ-DNA分子的篩選較為方便；重組λ-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便；λ-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因；第三章-基因工程的載體二.M13單鏈?zhǔn)删wDNA載體

M13是絲狀的大腸桿菌噬菌體，顆粒內(nèi)含有6.4k核苷酸的閉合環(huán)狀單鏈DNA（+）基因組。第三章-基因工程的載體環(huán)形DNA分子從其復(fù)制起始點(diǎn)開始復(fù)制，導(dǎo)致復(fù)制泡形成。這種含有復(fù)制泡的復(fù)制中間體的形狀類似于希臘字母θ型結(jié)構(gòu)?！唉取宝葟?fù)制第三章-基因工程的載體滾環(huán)式復(fù)制(rollingcirclereplication)是噬菌體中常見的DNA復(fù)制方式。第三章-基因工程的載體M13的生命周期M13通過大腸桿菌性菌毛進(jìn)入寄主細(xì)胞（外殼蛋白脫落）?復(fù)制200拷貝第三章-基因工程的載體M13的特點(diǎn)M13并不是在寄主細(xì)胞內(nèi)包裝成噬菌體顆粒的，（+）DNA先與結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜，然后結(jié)合蛋白脫落，最后（+）DNA從細(xì)胞膜上向胞外溢出，溢出過程中被外殼蛋白包裝成噬菌體顆粒。因此，M13并不發(fā)生溶菌現(xiàn)象，但噬菌體的大量繁殖也干擾了寄主細(xì)菌的正常生長(zhǎng)，所以仍可產(chǎn)生模糊的噬菌斑。因此，（+）DNA并不需要導(dǎo)入一種預(yù)先固定的結(jié)構(gòu)中，被包裝的（+）DNA分子量大小并無嚴(yán)格限制。第三章-基因工程的載體IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ′Polylinker（MCS）M13DNA載體的構(gòu)建在M13的基因II和基因IV之間有1長(zhǎng)度為507個(gè)NN的基因間區(qū)段（IG區(qū)段），外源DNA的插入該區(qū)段中，不影響M13噬菌體DNA的復(fù)制。第三章-基因工程的載體克隆的DNA片段以單鏈形式輸出細(xì)胞，制備單鏈的DNA用于測(cè)序、雜交探針、基因定點(diǎn)突變。M13重組分子篩選簡(jiǎn)便，被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大。M13的RFDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在，很容易純化出來作為基因克隆的載體使用。M13載體的特點(diǎn)和用途第三章-基因工程的載體M13載體的不足1.插入的外源DNA片段不穩(wěn)定，片段越大，越容易發(fā)生缺失和或重排。2.克隆外源DNA的實(shí)際能力十分有限，一般情況下其有效的最大克隆能力為1.5Kb。3.理論上，M13噬菌體中外源DNA片段有兩種插入方向，但實(shí)際上外源DNA總是按1種主要方向插入。第三章-基因工程的載體第三節(jié)柯斯質(zhì)粒載體

λ-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，柯斯質(zhì)粒的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。構(gòu)建思路：

在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長(zhǎng)度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，同時(shí)又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒。第三章-基因工程的載體柯斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有

DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，cosmid是cossitecarryingplasmid的縮寫。由3部分組成：

A.多克隆位點(diǎn)區(qū)

B.含有cos位點(diǎn)的DNA區(qū)

C.復(fù)制起始位點(diǎn)和抗性標(biāo)記區(qū)第三章-基因工程的載體柯斯（cosmid）質(zhì)粒載體：也稱粘粒，是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及λ噬菌體用于包裝的cos末端等。該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。第三章-基因工程的載體柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)1.具有噬菌體的特性柯斯質(zhì)粒連接上適宜長(zhǎng)度的外源DNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主細(xì)胞。進(jìn)入寄主細(xì)胞的DNA也能環(huán)化和復(fù)制，但是不會(huì)形成新的噬菌體顆粒，也不能發(fā)生溶菌現(xiàn)象。2.具有質(zhì)粒載體的特性能象質(zhì)粒一樣在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，且?guī)в锌剐赃x擇標(biāo)記基因，有些還帶有插入失活型的多克隆位點(diǎn)，為重組體的篩選提供了方便。3.高容量的克隆能力

cos質(zhì)粒本身很小，只有復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記和cos位點(diǎn)等構(gòu)成，所以其克隆上限可達(dá)45kb左右。不過由于包裝的限制，其克隆片段至少要達(dá)到30kb。第三章-基因工程的載體1978年，Collins和Hone發(fā)明構(gòu)建。例如：柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和λ噬菌體的cos位點(diǎn)的一段DNA構(gòu)成，全長(zhǎng)4.3kb。第三章-基因工程的載體

設(shè)計(jì)構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長(zhǎng)4-6kb。其上的cos位點(diǎn)的一個(gè)重要作用是識(shí)別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長(zhǎng)度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似λ噬菌體的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源DNA可達(dá)到45kb。重組的柯斯質(zhì)?？上螃耸删w一樣感染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。第三章-基因工程的載體第三章-基因工程的載體第三章-基因工程的載體采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難①載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接。第三章-基因工程的載體②柯斯質(zhì)粒裝載能力大，可能使基因組上并非相鄰小片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后來專門選出35～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時(shí)，每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段，因?yàn)槿绻€(gè)片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；20kb20kbBglIIBglIIBglIIBglII酶切與載體連接第三章-基因工程的載體第四節(jié)噬菌粒載體由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列。①具質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便DNA的操作，形成的雙鏈DNA穩(wěn)定又高產(chǎn)；②又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)、包裝序列，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。第三章-基因工程的載體質(zhì)粒pUC19與噬菌粒pUC119第三章-基因工程的載體噬菌粒載體的特點(diǎn)：●能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞；●裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb）；●能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制；●具有抗性標(biāo)記重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易；●通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單鏈DNA第三章-基因工程的載體質(zhì)粒λ噬菌體柯斯質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w克隆DNA大片段±*++-構(gòu)建基因組文庫(kù)-++-構(gòu)建DNA文庫(kù)+---常規(guī)的亞克隆化+---構(gòu)建新型的DNA結(jié)構(gòu)+---序列分析+--+單鏈探針+**--+外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)+---四種常用載體的比較*外源DNA如超過10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和DNA得率都非常低**已有個(gè)別材料可用于此目的第三章-基因工程的載體第五節(jié)人工染色體載體人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時(shí)，柯斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。真核生物基因組長(zhǎng)度，遠(yuǎn)大于質(zhì)粒、噬菌體DNA等，能否將真核生物染色體去掉非必須區(qū)域，作為克隆載體，裝載更大的外源DNA片段？第三章-基因工程的載體真核生物的染色體有幾個(gè)關(guān)鍵部位：著絲粒端粒復(fù)制序列

分離這些元件并通過DNA體外重組技術(shù)將它們連接起來構(gòu)成人工染色體。第三章-基因工程的載體將染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。人工染色體載體（artificialchromosomevector）:利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體。第三章-基因工程的載體酵母人工染色體載體，實(shí)際上是一種“穿梭”克隆載體。其含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的第一受體源(大腸桿菌)質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。這樣的克隆載體在第一受體細(xì)胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)入高拷貝復(fù)制。這種克隆載體在體外與目的DNA片段重組后，轉(zhuǎn)化第二受體細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)按染色體DNA復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。篩選第一受體的克隆子，一般采用抗菌素抗性選擇標(biāo)記；而篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點(diǎn)是能容納長(zhǎng)達(dá)1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。酵母人工染色體(YeastArtificialChrom