微生物工程第三章發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基設計

微生物工程第三章發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基設計第一頁，共73頁培養(yǎng)基：指用于維持供微生物生長繁殖和產物形成所需的一組營養(yǎng)物質和原料。發(fā)酵培養(yǎng)基的作用：

滿足菌體的生長促進產物的形成第二頁，共73頁單位培養(yǎng)基能產生最大量的目的產物；能夠使目的產物合成速率最大；能夠使副產物合成的量最少；所采用的培養(yǎng)基應該質量穩(wěn)定、價格低廉、易于長期獲得；盡量不影響工業(yè)好氣發(fā)酵中的通氣攪拌性能以及發(fā)酵產物的后處理。工業(yè)發(fā)酵微生物培養(yǎng)基的共性：第三頁，共73頁發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的基本要求發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的成分及來源微生物的培養(yǎng)基類型發(fā)酵培養(yǎng)基的設計原理與優(yōu)化方法本章內容：第四頁，共73頁第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的基本要求工業(yè)培養(yǎng)基：

指提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產物所需要的，按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質的混合物。第五頁，共73頁提供合成微生物細胞和發(fā)酵產物的基本成分；提高單位營養(yǎng)物質的轉化率；提高單位容積發(fā)酵罐的生產能力；提高產物的合成速度，縮短發(fā)酵周期；減少副產物和“三廢”物質，便于分離純化；原料價格低廉，質量穩(wěn)定，取材容易；減少對發(fā)酵通氣攪拌的影響，降低能耗。工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵的培養(yǎng)基的設計要求：重點第六頁，共73頁第二節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源一、碳源1、作用①提供微生物菌種生長繁殖所需的能源及合成菌體所必需的碳骨架；②提供菌體合成目的產物的原料。2、來源糖類、油脂、有機酸、正烷烴、低碳醇等第七頁，共73頁3、工業(yè)上常用的糖類①葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖會引起葡萄糖效應過量加速菌體呼吸，導致溶解氧不能滿足需要

工業(yè)上常用淀粉水解糖,但是糖液必須達到一定的質量指標第八頁，共73頁不同的制糖工藝生產的糖液質量差別很大第九頁，共73頁②糖蜜

糖蜜是制糖生產時的結晶母液，它是制糖工業(yè)的副產物。

糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。第十頁，共73頁第十一頁，共73頁不同加工方法對甘蔗糖蜜的影響：第十二頁，共73頁糖蜜使用應注意除雜：

除糖份外，含有較多的雜質，其中有些是有用的，但是許多都會對發(fā)酵產生不利的影響，需要進行預處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結晶）、鈣鹽（結晶）生物素（發(fā)酵控制）預處理：澄清→脫鈣→脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質：鐵離子含量高（導致異檸檬酸的生成）預處理：→黃血鹽（亞鐵氰化鉀：作為除鐵劑）第十三頁，共73頁③

淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時加入一定的α-淀粉酶成分比較復雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點：來源廣泛、價格低廉，可以解除葡萄糖效應第十四頁，共73頁例：地衣芽孢桿菌生產α-淀粉酶碳源對生長和產酶的影響：碳源細胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2第十五頁，共73頁李江華，無錫輕工大學學報，2004(1.5g麩皮)第十六頁，共73頁嗜堿芽胞桿菌(AC-2)中碳源對堿性纖維素酶分泌的影響結果：各種碳源相差不大推論：該菌種的堿性纖維素酶為組成型蘇勤，林業(yè)化學與工業(yè)，2004第十七頁，共73頁４、油和脂肪油、脂肪甘油＋脂肪酸CO2＋H2OATP脂肪酶氧氣※供氧要充足，否則會使有機酸積累，引起pH下降常用：豆油、菜油、葵花籽油、豬油、魚油、棉籽油等第十八頁，共73頁發(fā)酵過程中會使pH上升CH3COONa＋O2→CO2+H2O+NaOH常用：乳酸、檸檬酸、乙酸５、有機酸及其鹽第十九頁，共73頁正烷烴（C14～18)、乙醇、甲醇等菌體收、得率較高６、烴和醇類第二十頁，共73頁二、氮源氮源主要用于構成菌體細胞物質（氨基酸，蛋白質、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。

1、無機氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點：吸收利用快（速效氮源），常引起pH的變化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH第二十一頁，共73頁生理酸性物質——經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質的無機氮源（如硫酸胺）；生理酸性物質——經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成堿性物質的無機氮源（如硝酸鈉）；所以選擇合適的無機氮源有兩層意義：

滿足菌體生長穩(wěn)定和調節(jié)發(fā)酵過程中的pH正確使用生理酸堿性物質，對穩(wěn)定和調節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用！第二十二頁，共73頁毛霉產蛋白酶的研究：陳濤，中國釀造，2004初始pH的影響:pH偏酸比較好，中性蛋白酶影響大初始pH對毛霉產蛋白酶活的影響第二十三頁，共73頁無機氮源的影響：硫酸銨>硝酸銨>硝酸鈉>脲毛霉產蛋白酶的研究：陳濤，中國釀造，2004第二十四頁，共73頁2、有機氮源來源：廉價原料（花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟等）。成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。例玉米漿：①可溶性蛋白、生長因子（生物素）②較多的乳酸、苯乙酸③硫、磷、微量元素等第二十五頁，共73頁

有機氮源成分復雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響。第二十六頁，共73頁氮源使用的一些相關問題：

有機氮源和無機氮源應當混合使用早期：容易利用易同化的氮源—無機氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質

有些產物會受氮源的誘導和阻遏例：蛋白酶的生產

有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力

開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍然是研究重點第二十七頁，共73頁三、無機鹽及微量元素1、作用：各種不一樣2、來源：C、N源，以鹽的形式補充3、用量：根據(jù)具體的產品，以實驗決定4、使用時應注意：對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮。例：青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20μg/ml

發(fā)酵罐必須進行表面處理第二十八頁，共73頁B.使用時注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產α-淀粉酶，pH對酶活的影響：

pH酶活不加4.25120分鐘加K2HPO45.4530分鐘加KH2PO44.6275分鐘第二十九頁，共73頁四、水對于發(fā)酵工廠，潔凈、恒定的水源至關重要。水源質量的主要考慮參數(shù)：pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質組成和含量。對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻。對于常規(guī)發(fā)酵，也需要可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。

第三十頁，共73頁五、生長調節(jié)物質

從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。

1、生長因子

有機氮源是這些生長因子的重要來源第三十一頁，共73頁概念：指加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結合到產物分子中去，其自身的結構并沒有多大變化，但是產物的產量卻因加入前體而有較大提高的一類化合物。2、前體青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136第三十二頁，共73頁作用：前體有助于提高產量和組份用量：按分子量衡算（考慮轉化率）例：6000單位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸？青霉素=6000*0.6（微克）=36mg/ml

苯乙酸=（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%實際使用時的轉化率在46-90%之間例某廠單耗為：0.337（kg/10億青霉素）轉化率為：0.6/(0.337*36/13.8)=68%第三十三頁，共73頁用法：前體使用時普遍采用流加的方法

前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利

例：苯乙酸，一般基礎料中僅僅添加0.07%

流加也有利于提高前體的轉化率前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化；

第三十四頁，共73頁

指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產量的添加劑。3、產物促進劑第三十五頁，共73頁促進劑提高產量的可能機制：本身是酶的誘導物；是表面活性劑；對酶的表面失活有保護作用；是沉淀或螯合有害的重金屬離子。第三十六頁，共73頁第三節(jié)微生物的培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基可按其組成物質的純度、狀態(tài)、用途分類一、按純度合成培養(yǎng)基

:原料其化學成分明確、穩(wěn)定

適合于研究菌種基本代謝和過程的物質變化規(guī)律

培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于工業(yè)生產

天然培養(yǎng)基:采用天然原料

原料來源豐富、價格低廉、適于工業(yè)生產

原料質量等方面不加控制會影響生產穩(wěn)定性

第三十七頁，共73頁M培養(yǎng)基(1L)：Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10g,pH7.0YPS培養(yǎng)基：酪蛋白胨（日本大五營養(yǎng)）10g，酵母提取物（英國Oxoid）5g,NaCl10g，pH7.2培養(yǎng)大腸桿菌常用兩種培養(yǎng)基第三十八頁，共73頁二、按狀態(tài)固體培養(yǎng)基

:適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產。半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。第三十九頁，共73頁斜面培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基三、按用途（從發(fā)酵生產應用考慮）可分為：第四十頁，共73頁要求：能使菌體生長快，產生孢子數(shù)量大、質量好，且不會引起菌種變異。對放線菌或霉菌產孢子培養(yǎng)基：C、N源不宜多，否則只長菌絲，少長或不長孢子；無機鹽濃度要適當控制，否則會影響孢子的顏色和孢子量。1.斜面培養(yǎng)基第四十一頁，共73頁要求營養(yǎng)豐富、完全，氮和維生素的含量高些；培養(yǎng)基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，便于孢子萌發(fā)生長；pH要穩(wěn)定；最后一級盡可能接近發(fā)酵培養(yǎng)基，常加入少量發(fā)酵合成期才大量需要的物質。2.種子培養(yǎng)基第四十二頁，共73頁目的：獲得高產量的發(fā)酵產物。要求：營養(yǎng)豐富完全，有利于產物合成；不能大量加入快C、N源，應和慢C、N源相結合；在產物分泌期間，pH穩(wěn)定；加入適量合成所需的前體等物質，定向發(fā)酵；采用中間補料，以提高發(fā)酵單位；原料的考慮——成本問題。3.發(fā)酵培養(yǎng)基第四十三頁，共73頁第四節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的設計原理與優(yōu)化方法培養(yǎng)基設計的重要性：對現(xiàn)存發(fā)酵培養(yǎng)基引用吸收的必要驗證；對菌種發(fā)酵條件認識的必需途徑；發(fā)酵技術建立的一個重要步驟；發(fā)酵生產成本控制的重要渠道。第四十四頁，共73頁一、發(fā)酵培養(yǎng)基的設計原理

確定培養(yǎng)基的組成成分確定各組分之間的最佳配比設計目的：第四十五頁，共73頁

目前還不能完全從生化反應的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學、細胞生物學、微生物學等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗配方，再結合所用菌種和產品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設備，按照一定的實驗設計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。

第四十六頁，共73頁培養(yǎng)基組分及濃度選擇需考慮的因素：菌體的同化能力代謝的阻遏和誘導合適的C、N比（100∶0.2～2.0）pH的要求重點第四十七頁，共73頁二、發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法

培養(yǎng)基設計與優(yōu)化一般過程：根據(jù)以前經(jīng)驗，初步確定可能的培養(yǎng)基組分單因子優(yōu)化實驗確定最為適宜的各組分及最適濃度多因子實驗進一步優(yōu)化重點第四十八頁，共73頁（1）理論轉化率與實際轉化率

理論轉化率：指理想狀態(tài)下根據(jù)微生物的代謝途徑進行物料衡算，所得出的轉化率的大小。

實際轉化率：指實際發(fā)酵過程中轉化率的大小

如何使實際轉化率接近于理論轉化是發(fā)酵控制的一個重要目標！第四十九頁，共73頁例:

如在酒精生產中葡萄糖轉化為酒精的理論轉化率計算如下∶葡萄糖轉化為酒精的代謝總反應衡算式為∶

C6H12O6─→2C2H5OH+2CO2

葡萄糖轉化為酒精的理論得率為∶

2*46

Y=───=0.52176第五十頁，共73頁第五十一頁，共73頁（2）實驗設計

培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過實驗獲得的

合理的實驗方法

正交實驗設計多因子實驗：響應面分析單因子實驗第五十二頁，共73頁方法結果培養(yǎng)基優(yōu)化的基本方法正交實驗均勻設計神經(jīng)網(wǎng)絡其他方法聚類分析響應面分析單因子實驗成本發(fā)酵單位第五十三頁，共73頁類胡蘿卜素高產菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健第五十四頁，共73頁原培養(yǎng)基:第五十五頁，共73頁

初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)第五十六頁，共73頁

通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進一步：乙酸鈉的濃度2%比較好第五十七頁，共73頁結果：碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無機鹽:復合無機鹽0.05%第五十八頁，共73頁

正交設計確定優(yōu)化的配方第五十九頁，共73頁第六十頁，共73頁改進后培養(yǎng)基原培養(yǎng)基改進后培養(yǎng)基的發(fā)酵結果第六十一頁，共73頁響應面優(yōu)化培養(yǎng)基配方：1、部分因子實驗（FFD）

初步篩選主要影響因子2、最陡爬坡實驗

確定主要影響因子最適取值范圍3、中心組合實驗（CCD）

確定最佳實驗點第六十二頁，共73頁響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基第六十三頁，共73頁搖瓶水平到反應器水平的優(yōu)化配方搖瓶、反應器培養(yǎng)基研究的兩個層次

搖瓶——培養(yǎng)基設計的第一步

反應器—最終的優(yōu)化的基礎配方第六十四頁，共73頁例：青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

輕質碳酸鈣1%發(fā)酵罐：葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量

4-8%，補加硫酸、前體等搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和罐的基礎培養(yǎng)基差別很大第六十五頁，共73頁搖瓶優(yōu)化配方：菌種篩選，反應器研究的基礎第六十六頁，共73頁發(fā)酵罐：反應器水平,

可以得出最終優(yōu)化的基礎配方第六十七頁，共73頁pH控制搖床：反應器水平上的搖瓶研究第六十八頁，共73頁培養(yǎng)基設計時注意的一些相關問題

原料及設備的預處理

原材料的質量

發(fā)酵特性的影響

培養(yǎng)基優(yōu)化與培養(yǎng)條件優(yōu)化