《生物化學(xué)》實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)與操作-趙春澎

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課座次安排：

（30人）座次安排：

（31人）座次安排：

（32人）座次安排：

（33人）座次安排：

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（35人）座次安排：

（36人）前言一、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課的重要性二、實(shí)驗(yàn)室守則1.整齊著裝、注意安全、尊師守紀(jì)；2.細(xì)心聽講、詳實(shí)記錄、按時(shí)作業(yè)；3.積極參與、規(guī)范操作、愛護(hù)儀器；4.有序值日、完成報(bào)告、批準(zhǔn)離開。理論成績(jī)占70分,實(shí)驗(yàn)成績(jī)占30分

（臨床專業(yè)討論課10分）三、實(shí)驗(yàn)考試出勤、實(shí)驗(yàn)室綜合表現(xiàn)、報(bào)告書寫10分實(shí)驗(yàn)理論考試10分實(shí)驗(yàn)操作考試10分四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫

實(shí)驗(yàn)X實(shí)驗(yàn)名稱【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹俊緦?shí)驗(yàn)原理】【實(shí)驗(yàn)步驟】【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】【結(jié)論分析】

（完成實(shí)驗(yàn)后隔日交實(shí)驗(yàn)報(bào)告，每組一份）生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)與操作一、目的：1.掌握常用玻璃儀器洗滌及干燥方法。2.熟悉幾種常用的液體混勻方法。3.掌握刻度吸量管及加樣槍的使用。4.掌握離心技術(shù)原理及掌握離心機(jī)的使用。5.掌握分光光度技術(shù)原理及722型分光光度計(jì)的使用。

玻璃儀器清洗程序一般玻璃儀器

毛刷刷洗容量分析玻璃儀器自來水沖洗蒸餾水沖洗

2-3次

自來水沖洗

2-3次洗液浸泡（12-24h）二、內(nèi)容（一）常用玻璃儀器的清洗與干燥（P9-10）標(biāo)準(zhǔn)：倒置顯示內(nèi)壁，既無成滴水珠，也不成股流下。

pH示中性。玻璃儀器的干燥：①自然干燥：將洗凈的玻璃儀器倒置在架子上使水瀝凈，

室溫下干燥；②加熱干燥:

容量?jī)x器不可高溫干燥；

精密分析量器如需即用，只能在60℃以下干燥；其他一般在105℃-120℃烘箱中干燥。（二）液體的混勻（P10-11）1.旋轉(zhuǎn)混勻法試劑量小，反應(yīng)時(shí)間短，小口徑容器2.彈動(dòng)混勻法適用于試管內(nèi)液體的混勻；3.倒轉(zhuǎn)混勻法適合具塞的容器，如容量瓶，磨口瓶；4.滴管混勻法用滴管將溶液反復(fù)吹打數(shù)次；5.玻棒攪拌混勻法大口徑或大容量的容器。（三）液體的量取1.

移液管2.

刻度吸量管3.

固定式微量吸量管（胖肚吸管）刻度吸量管的分類：兩種分類方法

規(guī)格（量取范圍）

用法（尖端殘液）分為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10ml。分為完全流出式與不完全流出式?！按怠?.

刻度吸量管刻度吸量管的使用方法：拿法：選?。喝∫海赫{(diào)刻度：放液：清洗：“靠近原則”“三點(diǎn)一線”食指堵塞上端開口，垂直地面插入液面下1~2cm管壁始終與地面垂直最后以蒸餾水潤(rùn)洗2~3次2.

刻度吸量管刻度吸量管使用中的注意事項(xiàng)：拿法：選?。喝∫海赫{(diào)刻度：放液：清洗：要求一次量取待測(cè)液體需要多少試劑，在管內(nèi)留下多少不允許以拇指堵塞上端開口插入液面下1~2cm即可禁止用嘴吹吸量管禁止甩吸量管2.

刻度吸量管刻度吸量管的使用：

“拿、選、取、調(diào)、放、洗”固定式微量吸量管的用途：一種量器，精確的試劑量取和轉(zhuǎn)移。3.固定式微量吸量管

又稱為加樣槍固定式微量吸量管的輔助設(shè)施：吸頭與吸頭盒3.固定式微量吸量管固定式微量吸量管的設(shè)計(jì)原理：柱塞定程運(yùn)動(dòng)的負(fù)壓原理密閉管腔吸頭移動(dòng)活塞3.固定式微量吸量管固定式微量吸量管的分類：不同分類方法

規(guī)格（量取數(shù)值）

用法（量取數(shù)量）分為1、2、10、20、250、500、1000ul等。分為單槍與排槍等。3.固定式微量吸量管固定式微量吸量管的使用方法：“輕取重放”取樣時(shí)：放液時(shí)：在第一次阻力處停止在第二次阻力處停止3.固定式微量吸量管固定式微量吸量管的注意事項(xiàng)：精密儀器，輕取輕用就近原則，準(zhǔn)確量取取液慢，防污染進(jìn)展快，多思考輕：準(zhǔn)：慢：變：3.固定式微量吸量管生活中的離心技術(shù)：（四）離心技術(shù)（P78）離心技術(shù)的概念：根據(jù)不同物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、密度不同，在同一轉(zhuǎn)速、同一部位受到的離心力不同而出現(xiàn)不同的沉降速度，從而達(dá)到濃縮、分離、純化目的的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。（四）離心技術(shù)離心技術(shù)的原理：①根據(jù)力學(xué)的基本原理

勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)物體受到的離心力:F=ρvrω2

F：物質(zhì)作勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)受的離心力

ρ：被分離物質(zhì)的密度v：物質(zhì)的體積r：離心半徑ω:離心角速度（四）離心技術(shù)離心技術(shù)的原理：由此可見：

在同一離心機(jī)中，同一轉(zhuǎn)速下，離心半徑和角速度平方的乘積是固定值，做勻速圓周運(yùn)動(dòng)的顆粒所受的離心力大小與顆粒密度相關(guān)。（四）離心技術(shù)離心技術(shù)的原理：②

沉降速度:離心時(shí)，在一定條件下顆粒在介質(zhì)中受力平衡，勻速運(yùn)動(dòng)，經(jīng)計(jì)算得：沉降速度V=D2×（ρ顆-ρ介）×rω2/18ηD:顆粒直徑η:介質(zhì)的粘度（四）離心技術(shù)離心技術(shù)的原理：②

沉降速度:介質(zhì)與顆粒的密度差決定著顆粒運(yùn)動(dòng)的方向、沉降速度。若ρ顆>ρ介，顆粒下沉若ρ顆=ρ介，顆粒懸浮若ρ顆<ρ介，顆粒上浮

（四）離心技術(shù)離心技術(shù)的常用分類：不同分類方法

速度目的制備性離心：如差速離心和密度梯度離心分析性離心普通離心（6000r/min以下）高速離心（20000~25000r/min）超速離心（50000~80000r/min）（四）離心技術(shù)離心技術(shù)的科研應(yīng)用：樣品的分離純化和制備；生物大分子分子量的測(cè)定；生物大分子純度的計(jì)算評(píng)估；生物大分子構(gòu)象的分析等。（四）離心技術(shù)檢查→配平→放置→離心→結(jié)束→收整注意：配平時(shí)，套管中加液體，

單管離心設(shè)配平管；放置時(shí)，對(duì)稱放置；離心時(shí)，取出多余套管，離心中勿開蓋；收整時(shí)，停轉(zhuǎn)后開蓋，速度旋鈕歸零。離心機(jī)的使用：離心機(jī)的使用：①檢查：儀器放置是否平整，是否有異常。②配平：離心管必須要兩兩配平③放置：等質(zhì)量的試管必須對(duì)稱放置

停轉(zhuǎn)后打開蓋速度旋鈕歸零三、注意事項(xiàng)1.容量分析玻璃儀器的清洗方法2.刻度吸量管的握持方法3.加樣槍的握持方法4.離心機(jī)的使用方法參考教材：學(xué)習(xí)資料：學(xué)習(xí)網(wǎng)站：生物化學(xué)微課：/course/201084535.html開工?。ㄎ澹┕庾V光度分析技術(shù)（P16）1.概念：光譜光度分析技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)具有吸收或發(fā)射輻射能的性質(zhì)，通過測(cè)量物質(zhì)所產(chǎn)生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度而建立起來的一種分析方法。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，測(cè)定簡(jiǎn)便，快速等優(yōu)點(diǎn)，

是最為常用的一種生化檢測(cè)技術(shù)。2.比色法與分光光度法有色溶液的顏色深淺，與溶質(zhì)濃度有關(guān)：

顏色越深，濃度越高；顏色越淺，濃度越低。比色法：利用比較溶液顏色的深淺來測(cè)知溶液中所含有色物質(zhì)濃度的方法。分光光度法與比色法相似，只是要求入射光更接近于單色光。3.

基本原理(1)有色溶液與光吸收的關(guān)系

光是一種電磁波。

人的視覺所能感覺到的光稱為可見光，波長(zhǎng)范圍在400～760nm；

我們?nèi)说难劬Ω杏X不到的還有紅外光（波長(zhǎng)大于760nm）、紫外光（波長(zhǎng)小于400nm）、X射線等。(2)光的吸收定律――Lambert－Beer定律當(dāng)一束平行的單色光通過均勻、無散射現(xiàn)象的溶液時(shí)，入射光與出射光強(qiáng)度如何變化。溶液的濃度愈大，則光被吸收得愈多。

通過的液層厚度愈大，則光被吸收得愈多。Ａ：吸光度：可以作為衡量光被吸收程度的一個(gè)物理量，吸光度越大，說明被溶液所吸收的光越多。Ｃ：物質(zhì)的濃度Ｌ：液層厚度。Ｋ：是指吸光系數(shù)，是一個(gè)比例常數(shù)。在一定條件下，吸光系數(shù)是物質(zhì)的特性常數(shù)之一，它與光的強(qiáng)度，溶液濃度，液層厚度都無關(guān)，只與入射光的波長(zhǎng)和物質(zhì)性質(zhì)有關(guān)。Lambert－Beer定律：A=KCL4.待測(cè)溶液濃度的計(jì)算：(1)標(biāo)準(zhǔn)管法在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)溶液的吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)溶液---就是用待測(cè)濃度的那種物質(zhì)，配成已知的濃度。根據(jù)朗伯-比爾定律公式標(biāo)準(zhǔn)溶液：A標(biāo)=KC標(biāo)L標(biāo)待測(cè)溶液：A測(cè)=KC測(cè)L測(cè)兩式相比A標(biāo)/A測(cè)=C標(biāo)/C測(cè)C測(cè)=A測(cè)C標(biāo)/A標(biāo)(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線法①先取與被測(cè)物質(zhì)含有相同組分的標(biāo)準(zhǔn)品，配成一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

然后分別測(cè)其吸光度。③作圖：以溶液濃度C為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖。CuSO4溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制范例：CuSO4溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線C(g/L)A管號(hào)123456CuSO4原液（mL）012345蒸餾水（mL）543210濃度值（g/L）01020304050吸光度（A）CuSO4溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制下午的實(shí)驗(yàn)操作：？空白管5.分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)與用法光源：

提供工作所需的所有波長(zhǎng)的光。單色器：?jiǎn)紊鞯淖饔檬菑牟ㄩL(zhǎng)范圍較寬的光線中，

分出單色光的一個(gè)裝置。吸收池：放置比色皿，是盛樣品或標(biāo)準(zhǔn)液的容器。石英比色皿(波長(zhǎng)≤350nm)，玻璃比色皿(波長(zhǎng)≥350nm)檢測(cè)器：對(duì)光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，并以電信號(hào)的形式表示，

這種光電轉(zhuǎn)化設(shè)備就被成為檢測(cè)器。顯示器：是將檢測(cè)器獲得的電信號(hào)放大，

并能將待測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)顯示出來的裝置。722G型分光光度計(jì)：722G分光儀的操作：開機(jī)→預(yù)熱→配置試劑→設(shè)置波長(zhǎng)

→校正儀器（調(diào)節(jié)“０%”和“100%”）

→測(cè)定→收整注意：調(diào)節(jié)“０%”和“100%”的方法和順序；比色皿的使用方法。開工！實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總（2018.09.03）：組號(hào)A2A3A4A5A6123456789101112實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總（2018.0